Page 37 - 《中国药房》2022年19期
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代成骨细胞按照20∶1的比例共同培养建立共育体系，下                                     表1 引物序列及产物长度
          同）。正常重力柚皮苷组：正常重力下 T 细胞与成骨细                          基因          引物序列（5′→3′）               产物长度/bp
          胞共育，加入 1×10     －5  mol/L 柚皮苷溶液（剂量依据文献              Runx2       上游引物：GCTTGATGACTCTAAACCTA   236
                                                                          下游引物：AAAAAGGGCCCAGTTCTGAA
          [13]设置，下同）。模拟微重力对照组：模拟微重力下 T                        IL-6        上游引物：CCCCCAGGAGAAGATTCCAA   221
          细胞与成骨细胞共育。模拟微重力柚皮苷组：模拟微重                                        下游引物：CGCAGAATGAGATGAGTTGT
                                            －5
          力下T细胞与成骨细胞共育，加入1×10 mol/L柚皮苷                        β-actin     上游引物：CTTCCTGGGCATGGAATCCT   306
                                                                          下游引物：TTGATCTTCATTGTGCTGGGTG
          溶液。根据文献[14]描述的实验方法建立模拟微重力环
                                                             2.9 成骨细胞中Runx2、IL-6蛋白相对表达的检测
          境：将模拟微重力对照组和模拟微重力柚皮苷组中的细
                                                                 采用Western blot法检测。按“2.4”项下操作分组处
          胞接种于 RCCS 内，加入胎牛血清 5 mL，然后加入完全
                                                             理细胞，使用 RIPA 裂解液提取蛋白，测定总蛋白浓度。
          培养基，用注射器排尽气泡。RCCS 设置转速为 30 r/
                                                             取定量后的蛋白与 PBS 混合，加热变性后进行凝胶电
          min，作用时间为 2 d（期间若产生气泡，立即将气泡赶
                                                             泳；然后加入 Runx2、IL-6、GAPDH 一抗（稀释度分别
          尽，以避免流体剪切力的影响）。正常重力对照组和正
                                                             为 1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后加
          常重力柚皮苷组于培养瓶中常规培养2 d。
                                                             入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（稀释度
          2.5 成骨细胞形态学观察
                                                             为 1∶5 000），室温孵育，显影。使用Image J软件分析蛋
              收集“2.4”项下分组处理的成骨细胞，在低倍镜视野
                                                             白条带，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比
         （×40）下观察各组成骨细胞的形态。
                                                             值表示目的蛋白的相对表达水平。
          2.6 成骨细胞增殖率检测
                                                             2.10  统计学分析
              采用CCK-8法检测。将“2.4”项下分组收集的成骨
                                                                 实验均重复 3 次以上。采用 SPSS 26.0 软件进行数
                                  3
          细胞进行浓度调整，以1×10 个/孔接种于96孔板，每孔
                                                             据分析，计量资料满足正态分布时以 x±s 表示，多组间
          加入200 μL细胞悬液，培养箱孵育4 h，细胞贴壁良好后                      比较采用方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。
          放入超净工作台，根据说明书要求向各孔中加入CCK-8                         检验水准α＝0.05。
          试剂 10 μL，轻轻摇晃均匀后放入细胞培养箱孵育 2 h，                     3 结果
          溶液变橙色后取出。另设只加培养基、不加细胞的空白                           3.1  成骨细胞形态学观察结果
          组同法操作。使用酶标仪检测 450 nm波长处的光密度                            显微镜下可见，与正常重力对照组比较，模拟微重
         （OD），计算各组细胞增殖率。细胞增殖率＝（给药组                           力对照组成骨细胞密度降低，仅有少量聚集，细胞形态
          OD－空白组OD）/（对照组OD－空白组OD）×100%。                      以圆形居多；与模拟微重力对照组比较，模拟微重力柚
          2.7  成骨细胞ALP活性检测                                   皮苷组成骨细胞成梭形或多角形，形态饱满，成鱼群状
              采用ALP试剂盒检测。收集“2.4”项下分组处理的                      聚集。结果见图1。
          成骨细胞，吸弃培养液，用 PBS 反复润洗后加入适量
          1%TritonX-100覆盖细胞。显微镜下观察细胞形态消失
          说明细胞已经裂解充分，然后把待测液体转移至96孔板
          中，根据试剂盒说明书要求，使用酶标仪检测520 nm波长
          处的 OD；同时提取细胞总蛋白，通过 BCA 蛋白浓度测
          定试剂盒测定蛋白浓度，再计算各组ALP活性。ALP活
                                                                  Ⅰ           Ⅱ           Ⅲ           Ⅳ
          性＝（检测 OD/标准 OD）×酚标准液浓度/样本蛋白浓
                                                                Ⅰ：正常重力对照组；Ⅱ：正常重力柚皮苷组；Ⅲ：模拟微重力对照
          度，其中标准 OD 为试剂盒中标准品检测出的 OD，酚标                       组；Ⅳ：模拟微重力柚皮苷组
          准液浓度为试剂盒标注浓度。                                           图1 各组成骨细胞形态学观察显微图（×40）
          2.8  成骨细胞中Runx2、IL-6 mRNA相对表达的检测                   3.2 成骨细胞增殖率检测结果
              采用实时荧光定量PCR法检测。按“2.4”项下操作                          CCK-8 法检测结果显示，与正常重力对照组比较，
          分组处理细胞，分别提取各组细胞总RNA，行RNA纯度                         正常重力柚皮苷组成骨细胞增殖率显著升高（P＜
          检测；逆转录合成 cDNA，以 cDNA 为模板进行扩增，扩                     0.05），模拟微重力对照组成骨细胞增殖率显著降低
          增产物行琼脂糖凝胶电泳；经实时荧光定量PCR反应后                         （P＜0.05）；与模拟微重力对照组比较，模拟微重力柚皮
          分析基因扩增的循环阈值（Ct 值），以 β-actin 为内参基                   苷组成骨细胞增殖率显著升高（P＜0.05）。结果见
          因，根据公式 2    －ΔΔCt 计算所得数值表示 Runx2 和 IL-6 的          图2A。
          mRNA相对表达水平。反应条件：95 ℃变性30 s，60 ℃                    3.3 成骨细胞ALP活性检测结果
          退火30 s，72 ℃延伸45 s（共40个循环）。引物序列及产                       ALP 试剂盒检测结果显示，与正常重力对照组比
          物长度见表1。                                            较，正常重力柚皮苷组成骨细胞ALP活性显著升高（P＜


          中国药房    2022年第33卷第19期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19  ·2335·
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