Page 36 - 《中国药房》2022年19期
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太空飞行中，暴露在微重力环境中的宇航员易出现                          Ⅱ型胶原酶、胎牛血清、PBS（货号或批号分别为D8371、
          骨密度降低、肌肉萎缩、肾功能降低、免疫功能紊乱等生                           20210519、1225C071、11011-8611、20211115）购自北京
                [1]
          理问题 。自从骨免疫学的概念首次提出以来，骨组织                            索莱宝科技有限公司；RIPA裂解液、0.25%胰蛋白酶、青
          与免疫细胞之间的相互作用受到越来越多研究者的关                             链霉素双抗、非离子型表面活性剂 TritonX-100、BCA 蛋
            [2]
          注 。太空实验研究表明，微重力下 T 细胞的激活显著                          白 浓 度 测 定 试 剂 盒（批 号 分 别 为 0803320200921、
          减少，白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、γ-干扰素等炎              071019190812、080421211029、P0096、062521211026）购
          症因子的分泌水平也显著改变             [3―4] 。                   自上海碧云天生物技术有限公司；ALP 试剂盒（批号
              骨碎补是一味补肾壮骨中药材，具有抗炎、加速骨                          20210722）购自南京建成生物工程研究所；茜素红染液
          折愈合、预防及治疗骨质疏松等功效                 [5―6] 。笔者课题组
                                                             （批号0518A21）购自北京雷根生物技术有限公司；CCK-
          的前期研究表明，在模拟微重力下骨碎补能够促进成骨
                                                              8 试剂盒（批号 209586）购自上海尚宝生物科技有限公
          细胞-破骨细胞共育体系中的成骨细胞增殖，提高碱性
                                                              司；TB Green 实时荧光定量 PCR MasterMix 试剂盒、逆
          磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，上调 Runt 相关          转录试剂盒（货号分别为 RR420A、RR036Q）购自日本
          转录因子 2（Runt related transcription factor 2，Runx2）和
                            [7]
          骨保护素的基因表达 。柚皮苷是从骨碎补中提取的活                            TaKaRa公司；Runx2兔源抗体、IL-6兔源抗体、磷酸甘油
                                                              醛脱氢酶（GAPDH）兔源抗体、辣根过氧化物酶标记的
          性成分，具有抗氧化、抗炎、降低胆固醇、改善微循环等
          多种药理作用       [8―9] 。近年来，柚皮苷的骨保护作用被广                 山 羊 抗 兔 免 疫 球 蛋 白 G（IgG）二 抗（批 号 分 别 为
                                                              BA12249456、BA12227886、BA09211756、BA01235136）
          泛研究。有研究表明，柚皮苷在去卵巢大鼠骨质疏松模
          型中能够促进骨形成，同时促进体外成骨细胞的增殖、                            购自北京博奥森生物技术有限公司。
          提高ALP活性     [10―11] ；也可以提高伤口组织的生长因子水                2 方法
          平，下调 IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子 α 的 mRNA 表达 。                 2.1  成骨细胞培养
                                                       [12]
          本研究通过建立T细胞-成骨细胞共育体系，探究模拟微                               SD乳鼠使用颈椎脱位法处死，乙醇消毒，无菌条件
          重力下柚皮苷对成骨细胞增殖分化的影响，以期为航空                            下分离取出颅顶骨，去除骨膜、血管等结缔组织，将颅顶
          医学应对失重性骨质丢失及临床上防治废用性骨质疏                             骨剪成碎骨片；加入0.25%胰蛋白酶作用30 min，弃去胰
          松提供一定的理论基础和研究思路。                                    蛋白酶，再加入Ⅱ型胶原酶消化 60 min，以 1 200 r/min
          1 材料                                                离心5 min，加入含10％胎牛血清及1％青链霉素双抗的
          1.1  实验动物与细胞                                        DMEM 培养基（以下简称“完全培养基”），制成细胞悬
              3 日龄 SD 乳鼠 12 只，由哈尔滨医科大学附属第二                    液，接种到培养皿中培养，之后每 2 d 换液 1 次。取第 3
          医院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为                              代原代颅顶骨细胞经茜素红染液染色后，置于显微镜下
          SCXK（黑）2021-001，用于提取原代颅顶骨成骨细胞。                      观察，若有成骨细胞分化成熟的标志——矿化结节，则
          小鼠T细胞购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。                           该原代颅顶骨培养的细胞为成骨细胞，之后选择第3代
          实验方案经哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会                             成骨细胞进行后续实验。
          批准，批件号为SYDW2022-058。                                2.2  T细胞培养
          1.2  主要仪器
                                                                  将储存于冻存管中的 T 细胞放入 37 ℃水浴锅内复
              X70 型光学倒置相差显微镜购自日本 Olympus 公                    苏，期间轻轻摇晃，融化后放入超净工作台内，将细胞悬
          司；HF240型细胞培养箱购自德国Heraeus公司；DL-CJ-
                                                              液转移至离心管内，再加入10倍体积的完全培养基，以
          2NDⅡ型超净工作台购自东联北方科技（北京）有限公                           1 200 r/min离心5 min，弃去上清液，加入完全培养基，轻
          司；ST-16R 型高速冷冻离心机购自美国 Thermo Fisher
                                                              轻吹打均匀，接种到培养瓶，放入细胞培养箱，24 h后半
          Scientific 公司；NY 14831 型离心管、430488 型冻存管、
                                                              量换液，之后每 2 d 换液 1 次。收集 T 细胞进行计数，调
          96 孔板购自美国 Corning 公司；Infinite M200 型多功能
                                                              整细胞密度为5×10 个/mL。
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          酶标仪购自奥地利Tecan公司；Applied Biosystems 7500
                                                              2.3 柚皮苷溶液配制
          型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪购自美国ABI
          公司；PowerPac  TM  Basic 电泳仪购自美国 Bio-Rad 公司；              取柚皮苷17.4 mg，溶于6 mL二甲基亚砜中，配制成
          Tanon GIS2010全自动数码凝胶成像系统购自上海天能                      浓度为5×10    －3  mol/L的母液，在超净工作台内过滤除菌
          科技有限公司；BP310P型称量天平购自德国Sartorius公                    后用完全培养基将母液稀释为1×10              －5  mol/L（此时二甲
          司；TY3062 型旋转细胞培养系统（rotary cell culture sys‐         基亚砜终体积分数＜0.1%），再置于4 ℃冰箱保存备用。
          tem，RCCS）购自上海易扩仪器有限公司。                              2.4 实验分组与处理
          1.3  主要药品与试剂                                            本实验设正常重力对照组、正常重力柚皮苷组、模
              柚皮苷（批号PCS-201021，纯度≥98%）购自成都植                   拟微重力对照组、模拟微重力柚皮苷组。正常重力对照
          标化纯生物技术有限公司；二甲基亚砜、DMEM培养基、                          组：正常重力下T细胞与成骨细胞共育（将T细胞与第3


          ·2334·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19                                 中国药房    2022年第33卷第19期
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