Page 31 - 《中国药房》2022年18期
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2.3.7  洗脱剂体积分数对洗脱效果的影响                 同“2.3.4”      表2 桦褐孔菌总三萜粗提物纯化的验证试验结果
          项下方法装柱、上样，吸附饱和后用 200 mL 的 7 种不同                     序号      纯化前                    纯化后
                                                                 质量/mg  总三萜质量分数/%  质量/mg  总三萜质量分数/%  平均值/%  RSD/%
          体积分数（20%、30%、40%、50%、60%、75%、95%）的乙                 1   280.00  34.36   90.69    72.58
          醇进行洗脱，测定洗脱液中桦褐孔菌总三萜的质量浓                             2   280.00  34.36   94.45    74.12   73.39  1.05
                                                              3   280.00  34.36   96.22    73.47
          度，按解析率公式计算洗脱率。结果显示，上述体积分
                                                             2.4 桦褐孔菌总三萜纯化物的体外抗肿瘤活性研究
          数乙醇洗脱液的洗脱率分别为15.27%、19.05%、33.40%、
                                                             2.4.1  供试品溶液的制备          精密称取桦褐孔菌总三萜
          40.14%、57.77%、61.26%、98.16%，可见洗脱率和乙醇体
                                                             纯化物适量，置 EP 管中，加二甲基亚砜涡旋溶解，加
          积分数呈正相关。以体积分数＜50% 的乙醇洗脱后经
                                                             RPMI1640细胞维持液稀释至二甲基亚砜的体积分数为
          浓缩冻干得到的固体呈深褐色，可见杂质较多；体积分                           0.1%，涡旋混匀，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得供试品
          数为60%和70%的乙醇洗脱率较低；以体积分数为95%                        溶液，质量浓度为1 mg/mL。
          的乙醇洗脱后经浓缩冻干得到的固体呈淡黄色，且洗脱                           2.4.2  阳性对照药物溶液的制备            精密称取顺铂适量，
          率最高。因此本实验最终确定先用 50% 的乙醇进行洗                         置EP管中，按“2.4.1”项下方法制成阳性对照药物溶液，
          脱，弃去非目标部分，然后用95%的乙醇进行洗脱，收集                         质量浓度为0.4 mg/mL。
          目标部分。                                              2.4.3  细胞增殖实验       HeLa细胞经3次传代后，用乙二

          2.3.8  洗脱剂用量对洗脱效果的影响               同“2.3.4”项下      胺四乙酸-0.25% 胰酶消化至游离状态，进行细胞计数，
          方法装柱、上样，吸附饱和后先用 50% 的乙醇 40 mL 除                    稀释细胞液至1×10 个/mL。将细胞接种于96孔板中，
                                                                               6
          杂，再用 95% 的乙醇以 1.0 mL/min 流速进行洗脱，每流                 每孔100 μL，培养至细胞铺满孔80%时即可使用。实验
          出 20 mL 洗脱液测定 1 次洗脱率，考察 20～240 mL 的                设置对照组、顺铂组和桦褐孔菌总三萜组。取上述供试
          95% 乙醇对洗脱率的影响。结果显示，第 1～12 份洗脱                      品溶液和阳性对照药物溶液，均二倍比稀释制得8个梯

          液 的 洗 脱 率 分 别 为 39.94%、15.35%、13.88%、6.42%、        度浓度，然后接种于细胞长至80%以上的96孔板中，培
          6.19%、4.05%、3.33%、2.97%、1.24%、1.09%、0.73%、         养 48 h，每个浓度设 6 个复孔。采用 MTT 染色法测定
          0.62%，可见第9～12份洗脱液的洗脱率很低，且差异不                       490 nm波长处的光密度，计算得桦褐孔菌总三萜纯化物
                                                             和 顺 铂 对 HeLa 细 胞 的 半 数 抑 制 浓 度（IC50 ）分 别 为
          大，表明此时大孔吸附树脂吸附的总三萜成分已被充分
                                                             184.20、20.10 μg/mL，可见桦褐孔菌总三萜纯化物对
          洗脱，故选择洗脱剂用量为160 mL。
                                                             HeLa细胞具有一定的抑制作用。
          2.3.9  洗脱流速对洗脱效果的影响              同“2.3.4”项下方
                                                             2.4.4  细胞迁移实验       实验设置对照组、顺铂组和桦褐
          法装柱、上样，吸附饱和后先用50%的乙醇40 mL除杂，
                                                             孔菌总三萜低、中、高剂量组，对照组细胞加入含 2% 胎
          再用 95% 的乙醇 160 mL 以不同流速进行洗脱，考察
                                                             牛血清和0.5%双抗的RPMI1640培养基，药物组细胞加
          1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min 的流速对洗脱率的影响。结果
                                                             入含100、150、200 μg/mL供试品溶液（或20 μg/mL阳性
          显示，上述流速下的洗脱率分别为 84.67%、87.49%、
                                                             对照药物溶液）、2%胎牛血清和0.5%双抗的RPMI1640培
          92.29%、70.12%，可见当流速为3.0 mL/min时，洗脱率最
                                                             养基，每个浓度设3个复孔，采用倒置显微镜分别记录培
          高，故选择流速为3.0 mL/min。
                                                             养 0 h 和 48 h 的划痕间距（图 3），使用 Image J V1.53c 软
          2.3.10  纯化工艺验证       称取同一批桦褐孔菌总三萜粗
                                                             件计算细胞迁移率，并使用 GraphPad 8.0.2 软件进行统
          提物3份，按照最佳纯化工艺条件进行纯化，即选用AB-
                                                             计学分析，计量资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因
          8 型大孔吸附树脂，上样液质量浓度为 2.0 mg/mL，上样                    素方差分析，组间两两比较用 LSD 检验。结果显示，对
          体积为 140 mL，上样流速为 1.0 mL/min；洗脱时先用                  照组、顺铂组和桦褐孔菌总三萜低、中、高剂量组的细胞
          50% 的乙醇 40 mL 除杂，再用 95% 的乙醇 160 mL 洗脱，             迁 移 率 分 别 为（43.04±1.60）% 、（12.64±0.40）% 、
          洗脱流速为3.0 mL/min，考察纯化前后桦褐孔菌总三萜                     （26.99±0.73）%、（16.32±0.34）%、（9.78±0.41）%，RSD
          粗提物的质量和总三萜质量分数（表 2）。表 2 显示，与                       分别为3.71%、3.17%、2.72%、2.07%、4.22%（n＝3），可见

          纯化前相比，总三萜质量分数明显升高，纯化后总三萜                           细胞迁移率随着桦褐孔菌总三萜纯化物质量浓度的升
          质量分数的 RSD 为 1.05%（n＝3），说明本纯化工艺合                    高而降低。与对照组相比，各药物组的细胞迁移率均显
          理、可行。                                              著降低（P＜0.01）。


          中国药房    2022年第33卷第18期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 18  ·2201·
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