Page 29 - 《中国药房》2022年18期
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宫颈癌主要由人乳头瘤病毒引起，是一种会严重危                         自美国 Invitrogen 公司；AO/EB 试剂盒（批号 BB-4132-
                                      [1]
          害女性健康的生殖系统恶性肿瘤 。据统计，宫颈癌的                           100T）购自上海贝博生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液
          发病率和病死率均居全球第4位，且近年来呈年轻化的                          （PBS）和二甲基亚砜（批号分别为21036449、EZ6789C15
              [2]
          趋势 。中医药在我国肿瘤患者的防治中发挥着重要作                           0）均购自兰杰柯科技有限公司。
          用，调查发现，大多数肿瘤患者的诊疗过程都有中医药                           1.3 细胞株
          的参与   [3―4] 。中药治疗具有多途径、多靶点、副作用小等                       人宫颈癌细胞株HeLa购自上海启达生物科技有限
          特点，目前已经成为临床治疗肿瘤不可或缺的手段                             公司。
          之一  [5―6] 。                                        2 方法与结果

              桦褐孔菌 Inonotus obliquus 为多孔菌科、褐卧孔菌
                                                             2.1 桦褐孔菌总三萜粗提物的制备
          属的药食两用真菌，味微苦、性偏凉，以扶正为主，兼以
                                                                 经过前期正交实验，优化出桦褐孔菌总三萜的最佳
          祛邪，具有益气养血、滋阴生津、疏肝解郁等作用                     [7―9] 。
                                                             提取工艺如下：取桦褐孔菌粉末适量，置圆底烧瓶中，加
          动物实验和长期临床实践表明，桦褐孔菌具有良好的抗
                                                             12 倍量（mL/g，下同）95% 乙醇加热回流 2 次，每次 80
          肿瘤、降血糖和降血脂等药理活性，且尚未发现其明显
                                                             min，合并滤液，回收乙醇至无醇味，冷冻干燥得到桦褐
          的不良反应 。笔者前期已对桦褐孔菌的抗肿瘤谱和
                    [10]
                                                             孔菌总三萜粗提物，提取率约为2.136%。
          抗肿瘤活性部位进行了筛选，发现三萜类成分为其发挥
                                                             2.2 桦褐孔菌总三萜的含量测定
          抗肿瘤作用的主要有效部位之一，且对人宫颈癌细胞
                                                             2.2.1  对照品溶液的配制          精密称取桦褐孔菌醇对照
                                                   [10]
          HeLa具有良好的抑制效果，但作用机制尚不清晰 。此
                                                             品，加无水乙醇配制成质量浓度为0.16 mg/mL的对照品
          外还发现，桦褐孔菌提取物中总三萜含量较低。基于
                                                             溶液。
          此，本研究拟先对桦褐孔菌总三萜进行纯化，再对纯化
                                                             2.2.2  供试品溶液的配制          精密称取桦褐孔菌药材粉
          后的总三萜进行抗肿瘤活性探讨，为进一步阐明桦褐孔
                                                             末 5 g，按照“2.1”项下方法提取，冷冻干燥至 50 mL，
          菌抗肿瘤作用的物质基础及具体机制提供实验依据。
                                                             即得。
          1 材料
                                                             2.2.3  检测方法      精密量取“2.2.2”项下供试品溶液 50
          1.1  主要仪器
                                                             μL，置 10 mL 具塞试管中，100 ℃下水浴蒸干，加入 0.2
              本研究所用主要仪器包括 UV-6000 型紫外-可见分
                                                             mL 新配制的香草醛-冰醋酸溶液（质量浓度 0.05 g/mL）
          光光度计（上海元析仪器有限公司），FA2014 型十万分
                                                             和 0.8 mL 高氯酸，摇匀，70 ℃下水浴保温反应 15 min，
          之一电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），HF90
                                                             冷却至室温，加乙酸乙酯定容至5 mL，并利用紫外-可见
          型 CO2恒温培养箱（上海力申科学仪器有限公司），U-
                                                             分光光度计检测其在550 nm波长处的吸光度。
          LH100HG 型荧光显微镜（日本 Olmypus 公司），Primaide
                                                             2.2.4  方法学考察      按2020年版《中国药典》（四部）“分
          型倒置显微镜（日本 Hitachi 公司），Epoch2T 型酶标仪
                                                             析方法验证指导原则”进行方法学考察。结果显示，桦
         （美国BioTek公司）。
                                                                                                          2
          1.2  主要药品与试剂                                       褐 孔 菌 醇 的 回 归 方 程 为 Y＝0.058 9X－0.063 2（R ＝
              桦褐孔菌药材购自神农金康（湖南）原生态茶业有                         0.999 7）（式中 Y 为吸光度，X 为待测物质量浓度），线性
          限责任公司，经山东中医药大学药学院张晓平讲师鉴定                           范围为3.20～17.60 μg/mL；精密度、重复性、稳定性试验
          为真品。桦褐孔菌醇对照品（批号B50360，纯度≥95%）                      的RSD分别为0.71%、1.27%、0.89%（n＝6）；平均回收率
          和顺铂对照品（批号B24462，纯度≥98%）均购自上海源                      为 97.82%，RSD 为 2.35%（n＝6）。考察结果均符合《中
          叶生物科技有限公司；AB-8型大孔吸附树脂和X-5型大                        国药典》规定。
          孔吸附树脂（批号分别为 A875381、X875377）均购自上                   2.2.5  桦褐孔菌总三萜粗提物的含量测定                 精密称取
          海麦克林生化科技有限公司；D101型大孔吸附树脂（批                        “2.1”项下桦褐孔菌总三萜粗提物粉末 2 mg，用无水乙

          号20200624）购自国药集团化学试剂有限公司；MTT试                      醇溶解并定容至 10 mL，按“2.2.3”项下方法处理后测定
          剂（批号EZ6789C126）购自德国BioFroxx公司；Annexin              吸光度，代入回归方程计算质量浓度，再计算得桦褐孔
          Ⅴ-FITC 流式凋亡检测试剂盒（批号 BMS500FI-100）购                 菌总三萜粗提物中总三萜的含量为34.36%。


          中国药房    2022年第33卷第18期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 18  ·2199·
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