Page 24 - 《中国药房》2022年18期
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2.2 动物分组、造模及给药 显色后经苏木精复染，清水充分清洗反蓝，中性树胶封
将小鼠随机分为正常对照组、模型组、镇肝熄风汤 片。在显微镜下观察小鼠脑黑质区TH阳性神经元的表
组（25 g/kg）、牛膝组（4.5 g/kg）、白芍组（2.3 g/kg）及牛 达情况，采集图片，使用 Image-Pro Plus 6.0 软件计算平
膝-白芍药对组（6.8 g/kg），每组 10 只。除正常对照组 均光密度（平均光密度值越高表示 TH 阳性神经元表达
外，其他组采用附子煎液（4 g/kg）灌胃给药4周复制肝阳 越强）。
上亢型小鼠模型；附子灌胃结束后，腹腔注射MPTP（25 2.6 小鼠脑黑质相关氧化应激指标的检测
mg/kg）7 d，复制肝阳上亢型 PD 小鼠模型。在每次注射 采用生物化学法进行检测。取剩余 5 只小鼠，处死
MPTP1 h后，除正常对照组和模型组小鼠灌胃生理盐水 后，冰上快速取小鼠脑黑质，与“2.4”项下脑黑质合并，并
外，其余各组小鼠分别灌胃对应药液，在 MPTP 腹腔注 滴加预冷的生理盐水制备组织匀浆液，低温离心后取上
射7 d后，继续给予7 d，给药剂量参考文献[9]设置。 清液，依据相关试剂盒说明书测定T-AOC、MDA的含量
2.3 小鼠行为学检测 及SOD活性。
2.3.1 易激惹程度评分 参考文献[10]，造模结束后，对 2.7 小鼠脑黑质中Nrf2、Trxr1和Txnip mRNA表达的
小鼠易激惹程度进行评分。Ⅰ级：捉持颈部时尖叫、惊 检测
跳；Ⅱ级：捉持颈部时咬人；Ⅲ级：提尾时尖叫、惊跳甚至 采用实时荧光定量PCR法进行检测。取“2.6”项下
咬人或与同笼小鼠频繁打斗；上述情况不明显为0级。
脑黑质适量，使用 Trizol 试剂提取脑黑质总 RNA，反转
2.3.2 麻痹震颤评分 参考文献[11]，造模结束后，对小
录合成 cDNA，以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反
鼠麻痹震颤进行评分。0分：与正常小鼠相似，无任何症
应体系为：cDNA 模版 2 μL，dNTP 溶液 1.6 μL，上、下游
状；1分：出现竖毛、弓背、间断性细小震颤，但活动自如；
引 物 各 0.8 μL，BeyoTaq Buffer 2 μL，BeyoTaq DNA
2 分：出现吞咽频繁，频繁性震颤，后肢张开，颤尾，活动
Polymerase 0.1 μL，加双蒸水至 20 μL。PCR 反应条件
逐渐受限；3 分：出现流涎，持续性震颤，四肢僵硬，活动
为：95 ℃预变性 4 min；95 ℃变性 20 s，60 ℃退火 30 s，
受限；4分：因全身麻痹而死亡。
72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。采用 2 －ΔΔCt 法计算 Nrf2、
2.3.3 悬挂实验评分 参考文献[12]，造模结束后，将各
Trxr1和Txnip mRNA的相对表达量。
组小鼠倒置悬挂在长为30 cm、高为25 cm的铁丝上，将
2.8 小鼠脑黑质中 Nrf2、Trxr1 和 Txnip 蛋白表达的
两前爪置于铁丝中点处，而后放开小鼠，如小鼠双后爪
检测
抓住铁丝则得0分，如小鼠后爪反复抓取铁丝且可间断
采用Western blot法进行检测。取“2.6”项下脑黑质
抓握则得0.5分，如小鼠单只后爪抓握铁丝则得1分，如
适量，提取各组小鼠脑黑质总蛋白，用BCA法检测蛋白
小鼠双后爪均不能抓握铁丝则得 2 分，检测时间为 2
含量，将蛋白变性后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
min。
胶电泳分离，转膜，封闭，加入 Nrf2、Trxr1、Txnip、lamin
2.3.4 游泳实验评分 参考文献[13]，造模结束后，将各
B和GAPDH抗体（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃过夜；加
组小鼠放置于 40 cm×30 cm×20 cm 规格的水箱中，水
入生物素标记的IgG二抗（稀释比例为1∶1 000），于室温
温为（25±2）℃，水深为15 cm，记录小鼠3 min内的漂浮
下孵育 2 h，TBST 洗膜后进行 ECL 化学发光反应，使用
时间。评分标准为：漂浮0～30 s，记0分；漂浮31～90 s，
Image J软件对免疫印迹条带进行密度扫描。以Nrf2与
记1分；漂浮91～150 s，记2分；漂浮151～180 s，记3分。
2.4 小鼠脑黑质神经元的超微结构观察 内参蛋白lamin B，Trxr1、Txnip与内参蛋白GAPDH灰度
值的比值表示Nrf2、Trxr1和Txnip蛋白的表达水平。
药物干预结束后，每组随机取 5 只小鼠，处死后，冰
上快速取小鼠脑黑质，大小约 1 mm ，将脑黑质置于 2.9 统计学分析
3
2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定过夜，乙醇、丙酮梯度脱水， 使用 SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量资料以
环氧丙酮、环氧树脂浸透，环氧树脂包埋，制备半薄切片 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
和超薄切片，进行双重染色，于透射电子显微镜下观察 比较采用 LSD-t 检验，等级资料采用 Ridit 分析，检验水
小鼠脑黑质神经元的超微结构变化。 准α＝0.05。
2.5 小鼠脑黑质区TH阳性神经元的检测 3 结果
采用SP免疫组化法进行检测。取“2.4”项下脑黑质 3.1 牛膝-白芍药对对肝阳上亢型 PD 小鼠易激惹程度
适量，固定于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存72 h，脱水浸 的影响
蜡后进行石蜡包埋，制备冠状切片，脱蜡、水化处理后， 与正常对照组比较，模型组小鼠性情暴躁，易激惹
抗原修复，滴加TH抗体（稀释比例为1∶100），孵育过夜； 程度Ⅱ、Ⅲ级小鼠只数显著增加（P＜0.05）；与模型组比
磷酸盐缓冲液漂洗后滴加二抗孵育10 min，DAB工作液 较，各给药组易激惹程度Ⅰ级小鼠只数均增加，Ⅱ、Ⅲ级
·2194· China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 18 中国药房 2022年第33卷第18期
