Page 24 - 《中国药房》2022年17期
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脑缺血/再灌注（cerebral ischemia/reperfusion，CI/R）     试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号 32106）等。
        损伤是指大脑缺血缺氧一定时间后，恢复血液供应时造                            1.3 细胞和动物
                           [1]
        成的严重脑机能障碍 。目前，CI/R 损伤引起的严重脑                             小鼠海马神经元HT22细胞系由空军军医大学西京
        损伤和功能障碍是临床治疗中一个具有挑战性的问题，                            医院新药研发中心培养和保存。实验用动物为清洁级
        其发病机制可能与炎症反应、氧化应激等生物过程有                             雄性 SD 大鼠，共 18 只，体质量 200～220 g，购自空军军
        关，且尚未开发出可用于治疗CI/R损伤的安全可靠的靶                          医大学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（陕）-
        向药物。山柰酚（kaempferol，KAE）主要来源于姜科植                     2019-001。大鼠在动物房内适应性喂养1周后进行后续
        物山柰的根茎，属于黄酮类化合物，亦广泛存在于茶叶、                           实验。
                                                  [2]
        蔬菜及水果中。药理研究表明，KAE 具有抗炎 、抗氧                          2 方法
          [3]
                                            [8]
                                  [7]
        化 、抗癌    [4－6] 、改善脂质代谢 、保护大脑 等作用。然                  2.1 KAE-靶点-CI/R网络构建
        而，KAE 治疗 CI/R 损伤的蛋白靶标与生物过程仍不明                       2.1.1 KAE靶点的预测        从TCMSP数据库（https：//old.
        确。网络药理学研究和分子对接可以同时研究多种化                             tcmsp-e.com/tcmsp.php）获得 KAE 分子结构和结构式的
        学物质和作用靶点，从而为中药提供可能的研究途                             “canonical smiles”格 式 信 息 ；从 PubChem 数 据 库
        径 [9－10] 。基于此，本研究首先利用网络药理学研究筛选                     （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得 KAE 分子结构
        KAE 治疗 CI/R 损伤的作用靶点，分析其治疗 CI/R 损伤                   和结构式的“sdf”格式信息。选择物种为“Homo sapiens”，
        的可能作用机制，然后利用分子对接技术明确KAE与核                           通过 SwissTargetPrediction 数据库（http：//www.swisstar-
        心靶点的结合位点，最后利用体内外实验验证KAE发挥                           getprediction.ch/）预 测 靶 点 ；利 用 UniProtKB 数 据 库
        脑保护作用的可能机制，为 KAE 治疗 CI/R 损伤提供实                     （https：//www.uniprot.org/）使靶点名称标准化，并删除重
        验研究基础。                                              复数据。
        1 材料                                                2.1.2 CI/R 靶点的收集       在 GeneCards 数据库（https：//
        1.1  主要仪器                                           www.genecards.org/）和 NCBI 数据库（https：//www.ncbi.
            本研究所用主要仪器包括Multiskan Sky型酶标仪、                   nlm.nih.gov/gene/）中检索，关键词为“cerebral ischemia/
        371 型 CO2培养箱（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），       reperfusion”；在 Drugbank 数 据 库（https：//go.drugbank.
        YQX-Ⅱ型厌氧培养箱（上海跃进医疗器械有限公司），                          com/）中检索，关键词为“cerebral ischemic stroke”。收集
        CKX53 型生物显微镜（日本 Olympus 公司），BSC-1100                3个数据库的CI/R靶点检索结果，删除重复数据。
        ⅡA2-X 型生物安全柜（山东博科生物产业有限公司），                         2.1.3  共同靶点网络构建          将 KAE、CI/R 的靶点输入
        TD4 型台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公                           Venny 在线绘图工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/
        司），BSA124S型分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有                       venny/index.html），筛选 KAE 与 CI/R 的共同靶点，并利
        限公司]，QL-901型涡旋仪（海门市其林贝尔仪器制造有                        用 Cytoscape 3.7.1 软件（http：//www.cytoscape.org）构建
        限公司），Mini-TBC型转移槽、Mini-TBC型转移芯（北京                   共同靶点网络。
        凯元信瑞仪器有限公司），Mini chemi 500型凝胶成像系                    2.2  核心靶点网络构建
        统（北京赛智创业科技有限公司）等。                                   2.2.1  蛋白质-蛋白质相互作用网络构建               蛋白质-蛋白
        1.2  主要药品与试剂                                        质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络可阐明
            本研究所用主要药品与试剂包括KAE对照品（上海                         预测目标与其他蛋白质之间的关系。STRING 数据库
        源叶生物科技有限公司，高效液相色谱法测得其含量≥                           （https：//string-db.org/）可提供蛋白质间相互作用的信
        98％），BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液（陕西中晖赫                       息，通过 STRING 数据库构建 CI/R 与 KAE 共同靶点的
        彩 生 物 医 药 科 技 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为 PQ003、             PPI网络，利用Cytoscape 3.7.1软件实现PPI网络的可视
        BBO222），蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）、磷酸化            化展示。
        Akt（p-Akt）、Src、磷酸化 Src（p-Src）、甘油醛-3-磷酸脱             2.2.2  核心靶点预测       对 PPI 网络进行拓扑学分析，利
        氢酶（GAPDH）抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司，                          用Cytoscape 3.7.1软件中的CytoHubba插件筛选出结构
        批号分别为 180947、175108、LS194236、AC2102017D、            亲和力排名前 10 位的核心靶点。节点颜色越趋近红色
        GB11002），磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM 高糖培养基                     表示其连接的靶点越多，在 CI/R 损伤发生、发展中的作
        （美国Corning公司），DMEM无糖培养基（大连美仑生物                      用越重要。
        技术有限公司），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国 Merck                      2.3 分子对接
        Millipore 公司，批号 IPVH00010），HRP 标记的山羊抗兔                  分子对接是研究药物分子作用机制的一种方法。
        IgG 抗体（美国 Abbkine 公司），ECL 化学发光超敏显色                  从 RSCB PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）下载蛋白


        ·2066 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 17                                 中国药房    2022年第33卷第17期
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