Page 25 - 《中国药房》2022年17期
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质结构，并使用 PyMOL 软件去除每个蛋白质结构的结                        用。以BCA法测定总蛋白浓度，将蛋白高温变性后，取
        晶水和其他小分子，然后将其保存为“PDB”格式。将结                         等量蛋白质（20 μg）上样电泳，并转移至PVDF膜上。用
        构 文 件 导 入 AutoDock Vina 软 件 中 的 Autodock Tool      5％脱脂牛奶于室温下封闭 2 h，并在 4 ℃下与 Akt、
        1.5.6 程序，在化合物结构上添加原子电荷及氢，保存为                       p-Akt、Src、p-Src、GAPDH 一抗（稀释度均为 1 ∶ 1 000）孵
       “pdbq”格式。将化合物 KAE 的“mol2”格式文件导入                     育过夜，再将膜与 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（稀释
        Autodock Tool 1.5.6 程序，在化合物结构上添加原子电                度为1∶5 000）在37 ℃下孵育2 h。用ECL化学发光超敏
        荷，保存为“pdbqt”格式，作为对接配体。采用AutoDock                   显色试剂盒进行显影，采用凝胶成像系统 Lane 1D 软件
        Vina 软件模拟分子对接，确定核心靶点与 KAE 的结合                      对条带进行扫描以分析条带灰度值，以 Akt、p-Akt、Src、
        亲和力。以KAE与核心靶点的对接结合能来评价结合                           p-Src与内参蛋白（GAPDH）条带灰色值的比值表示蛋白
        亲和力，若分子对接的结合能＜－7 kcal/mol（1 kcal＝                  的表达水平，以磷酸化蛋白与对应未磷酸化蛋白的灰度
        4.186 kJ），说明具有亲和力，且结合能的数值越低，说明                     值比值反映该蛋白的磷酸化水平，并以对照组为参照。
        结合亲和力越低，结合越稳定 。                                    实验重复3次。
                                 [11]
        2.4 细胞体外实验验证                                       2.5 动物体内实验验证
        2.4.1  细胞培养      将 HT22 细胞接种于含 10％胎牛血              2.5.1  大鼠大脑中动脉阻塞模型的制备、分组与给
        清、1％青链霉素双抗的 DMEM 高糖培养基（即完全培                        药   采用随机数字表法将 18 只大鼠随机分为假手术组
        养基）中，置于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养。每 2 天更                    （Sham 组）、大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery oc-
        换1次培养基，待细胞融合度为90％左右时，用0.25％胰                       clusion，MCAO）组、KAE 组（剂量 20 mg/kg），每组 6 只。
        酶消化并进行传代培养。本研究选用第7代细胞进行后                           除Sham组不造模外，其余2组均造模。采用线栓法建立
        续研究。                                               大鼠MCAO模型：首先大鼠腹腔注射4％戊巴比妥钠麻
        2.4.2  氧糖剥夺/再灌注细胞损伤模型的制备、分组与给                      醉，仰卧固定，常规消毒，于颈部正中纵切口，分离出右
        药   实验分为对照组、氧糖剥夺/再灌注（oxygen-glu-                   侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉，动脉
        cose deprivation/reperfusion，OGD/R）组和 KAE 低、中、     夹暂时夹毕颈总动脉和颈内动脉；在颈外动脉结扎处远
        高剂量组。对照组细胞用完全培养基常规培养 24 h。                         心端剪一斜口，经此斜口插入顶端赖氨酸包被的线栓
        OGD/R组细胞用DMEM无糖培养基在37 ℃恒温、厌氧                       （直径 0.18 mm），经颈内动脉进入大脑前动脉的起始部
        培养箱（95％N2、5％CO2 ）中培养3 h，再用完全培养基代                   位，遇轻微阻力即停止；栓塞 2 h 后，拔出线栓，再灌注
                                                                                               [13]
        替 DMEM 无糖培养基常规培养 24 h，构建 OGD/R 细胞                  24 h，构建MCAO模型以模拟急性脑梗死 。Sham组仅
        损伤模型。KAE低、中、高剂量组细胞先参照OGD/R组                        钝性分离大鼠颈部正中切口。于再灌注同时，Sham 组
        厌氧培养3 h后，再分别加入含8、16、32 μmol/L KAE 的                及 MCAO 组腹腔注射生理盐水，KAE 组腹腔注射 20
        DMEM 无糖培养基常规培养 24 h。KAE 给药剂量参考                     mg/kg KAE。KAE给药剂量参考文献[14]和课题组前期
        文献[12]和课题组前期预实验结果设置。                               预实验结果设置。
        2.4.3  细胞活力检测        采用 CCK-8 法进行检测。将              2.5.2  大鼠神经功能评价         参照改良的Longa评分法对
                        4
        HT22 细胞以 5×10 个/孔接种于 96 孔板中，待细胞贴壁                  大鼠神经功能进行评分，按照 0～4 分进行评价。0 分：
        后，按“2.4.2”项下分组处理（每组设置3个复孔），同时设                     无明显神经功能缺损；1分：提尾时，对侧前肢不能前伸；
        置不含细胞和药物的空白对照组。培养结束后，更换为                           2 分：向缺血对侧转圈；3 分：不能承受对侧自身重量；4
        含 CCK-8 的培养基，在 37 ℃、5％CO2 培养箱中孵育 4                 分：意识障碍或无自主运动。评分越高，表明大鼠行为
                                                                     [14]
        h。使用酶标仪在 450 nm 波长处检测各孔的光密度                        障碍越严重 。
       （OD），并计算细胞存活率：细胞存活率（％）＝（实验组                         2.5.3  大鼠脑组织病理观察           采用 TTC 染色法进行观
        OD－空白对照组OD）/（对照组OD－空白对照组OD）×                       察。给药后，各组大鼠腹腔注射 4％戊巴比妥钠麻醉猝
        100％。实验重复3次。                                       死后立即摘除全脑，用预冷的1×PBS洗净，滤纸吸干，分
        2.4.4  HT22 细胞中 Akt、p-Akt、Src、p-Src 蛋白表达检          为2份。其中一份脑组织置于－20 ℃冰箱速冻30 min，
        测   采用 Western blot 法检测 Akt、p-Akt、Src、p-Src 蛋白     取出后在冰上切成 5 片（厚度 2 mm）。将切片置于 2％
        的表达，验证 KAE 对 HT22 细胞中上述蛋白的调控作                      TTC染液中，用锡箔纸盖住后，置于37 ℃恒温箱中放置
                             6
                                              2
        用。将HT22细胞以2×10 个/孔接种于25 cm 细胞瓶中，                   30 min，翻动脑组织切片，使其均匀接触到染液。取出切
        待细胞贴壁后，按“2.4.2”项下分组处理，用含1％蛋白酶                      片用PBS洗涤3～5 min，立即拍照，采用Image J 1.8.0软
        抑制剂的 4 ℃预冷的 RIPA 裂解液裂解细胞，细胞裂解                      件计算每一片脑组织的梗死区面积，分层计算面积，每
        液在 12 000×g、4 ℃下离心 10 min，收集上清液，保存待                一层的梗死面积之和称为梗死体积。TTC 染色为红色


        中国药房    2022年第33卷第17期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 17  ·2067 ·
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