Page 38 - 《中国药房》2022年16期
P. 38

低、高剂量组（0.87、3.46 g/kg），芎麻汤正丁醇提取物低、                  苯透明，中性树胶封片，用显微镜观察并用 Motic B5 显
        高剂量组（1.80、7.20 g/kg）。芎麻汤有效部位各剂量均                    微摄像系统采像。用Image-Pro-Plus图像分析软件分析
        根据成人临床剂量换算而得，为1、4倍等效剂量。SD大                          各组大鼠 TCC 内 TRPV1、CGRP、CRLR、RAMP1 的阳性
        鼠正常组8只，模型组12只，其余给药组每组10只。                           表达情况（镜下棕色或深棕色现象可以判断为阳性表达）。
        2.3 模型建立及药物干预                                       2.5.3  大 鼠 TCC 内 TRPV1、CGRP、CRLR、RAMP1
            肝阳上亢兼瘀血型偏头痛大鼠模型评价标准                     [6－8] ：  mRNA相对表达量的检测           采用RT-qPCR法进行检测，
        遵循中医药理论，参照《中药新药临床指导原则（试行）》                          每个样本检测3次。取“2.5.1”项下第2份标本0.02 g，依
        中有关偏头痛中医证候诊断标准，以大鼠双眼结膜颜色                            次加入TRIZOL试剂、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇提取
        加深变红，易激惹，频繁打斗，提尾时尖叫、惊跳甚至咬                           总 RNA，用无菌无酶水复溶后得 RNA 溶液。吸取 RNA
        人等宏观体征，作为肝阳上亢证模型复制成功的标准；                            溶液2 μL，用紫外分光光度计在260、280 nm波长处测定
        以大鼠电刺激时出现咀嚼肌收缩、口鼻分泌物增多，清                            其吸光度值，并计算浓度及纯度；另取RNA溶液3 μL按
        醒后出现节律性抖动头部、过度理毛、甩头、扭头等行为                           试剂盒说明书操作，以组织中总 mRNA 为模板，逆转录
        表现，以及被毛蓬松无泽，舌质紫暗或伴瘀斑、瘀点等宏                           cDNA（逆转录条件为 50 ℃孵育 50 min、85 ℃孵育 5
        观体征，作为瘀血型偏头痛模型复制成功的观察标准。                            min），以cDNA为模板进行RT-qPCR实验扩增。PCR反
        按此评价标准，最终模型组、阳性组及芎麻汤有效部位                            应体系（每个样本每个指标3个孔，每孔10 μL，共30 μL）
        各剂量组均保留8只大鼠。                                        包括：反转录产物 2 μL，上、下游引物各 1 μL，ddH2O 11
            除正常组（以10 mL/kg灌胃0.9％氯化钠溶液）大鼠                    μL，SYBGREEN PCR Master Mix（2×）15 μL。PCR反应
        外，其余各组大鼠均以2 g/kg灌胃等体积附子汤，每天1                        条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸
                                       [8]
        次，连续 4 周，复制肝阳上亢证模型 ；各给药组大鼠从                         30 s，40个循环。以正常组样品为对照样品，采用2                －ΔΔCt 法
        灌胃附子汤第15天起，同时灌胃等体积的相应药物，每                           计算各目的mRNA的相对表达量。
        天1次，连续2周，正常组、模型组则灌胃0.9％氯化钠溶                         2.5.4  大鼠TCC内TRPV1、CGRP、CRLR、RAMP1蛋白
        液。第29天，除正常组外，其余各组大鼠均参照课题组                           相对表达量的检测           采用 Western blot 法进行检测，每
        前期造模方法电刺激大鼠三叉神经节复制肝阳上亢兼                             个样本检测3次。取“2.5.1”项下第3份标本0.03 g，用预
        瘀血型偏头痛模型         [6－7] 。待大鼠清醒后，各组大鼠按前               冷的 PBS 冲洗后加入 RIPA 裂解液 400 μL 提取蛋白，测
        述方法再维持灌胃给药1次。                                       定蛋白上清液的浓度后，进行蛋白变性。将已变性蛋白
        2.4  大鼠宏观体征及行为表现观察                                  经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶电压
            电刺激时，观察大鼠是否存在咀嚼肌收缩、口鼻分                          80 V，分离胶电压 120 V，电泳时间 150 min）分离后，转
        泌物增多的症状；电刺激结束待大鼠清醒后、末次灌胃                            膜（恒定电流 300 mA，CGRP、RAMP1 30 min，CRLR 70
        30 min后观察其毛发、舌象、神情、性情等宏观体征及行                        min，TRPV1、β-actin 60 min）；用 5％脱脂奶粉室温封闭
        为表现，以判定造模是否成功。                                      2 h，加入一抗（TRPV1、RAMP1、CRLR 抗体稀释比例均
        2.5  取材及指标检测                                        为1 ∶ 1 000，CGRP抗体稀释比例为1 ∶ 1 500，β-actin稀释
        2.5.1  取材   观察大鼠宏观体征及行为表现后，深度麻                      比例为1∶5 000）室温孵育90 min，于4 ℃孵育过夜；加入
        醉大鼠，结扎腹主动脉，先用预冷的0.9％氯化钠溶液进                          二抗（R、M 稀释比例分别为1 ∶ 6 000、1 ∶ 5 000）孵育 1 h；
        行心脏灌注，当流出液体清亮时，再用预冷的现配4％多                           置于ECL显色液中孵育3 min，暗盒中曝光20 min后，显
        聚甲醛固定。大鼠灌注固定后取全脑组织，随即分离出                            影冲洗底片并扫描。采用Quantity one软件进行定量分
        TCC，分为 3 份：第 1 份置于 4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液                     析。目的蛋白相对表达量＝目的蛋白条带灰度值/内参
        （PBS）中，于－20 ℃冰箱保存，用于免疫组织化学法检                        β-actin条带灰度值。
        测；第2份置于加有RNA裂解液的冻存管中，于－80 ℃                         2.6 统计学方法
        冰箱冻存，用于RT-qPCR法检测；第3份直接置于冻存管                            采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以
        中，于－80 ℃冰箱保存，用于Western blot法检测。                     x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
        2.5.2  大鼠TCC内TRPV1、CGRP、CRLR、RAMP1阳性                比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
        表达的检测        采用免疫组织化学法进行检测，每个样本                     3 结果
        检测3次。取“2.5.1”项下第1份标本进行冰冻切片（5～7                      3.1 芎麻汤有效部位对大鼠宏观体征及行为表现的影响
        μm），经烤片、脱蜡、热修复抗原、灭活内源性酶后，滴加                             电刺激时，大鼠均出现了咀嚼肌收缩、口鼻分泌物
        稀释的一抗（TRPV1、CGRP、CRLR、RAMP1抗体稀释比                    增多的症状。电刺激结束待大鼠清醒后，与正常组相
        例均为1 ∶ 400），于4 ℃过夜，再用PBS冲洗3次；滴加稀                    比，模型组大鼠均出现了双眼结膜颜色加深变红，易激惹，
        释的二抗（稀释比例均为 1 ∶ 1 000）于 37 ℃孵育 30 min，              频繁打斗，提尾时尖叫、惊跳甚至咬人等宏观体征，以及节
        PBS 冲洗 3 次；用新配的 DAB 显色，室温孵育 5 min；最                 律性抖动头部、过度理毛、甩头、扭头等行为表现；同时被
        后，用蒸馏水洗涤，苏木素复染。贴片，晾干，脱水，二甲                          毛明显蓬松无泽，大部分大鼠的舌质出现紫暗，小部分甚


        ·1952 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 16                                 中国药房    2022年第33卷第16期
   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43