Page 33 - 《中国药房》2022年16期

表4 方差分析结果 表5 验证实验结果
因素 平方和 自由度 均方 F P 成分含量/（mg/g） 综合
模型 150.012 9 16.668 3.948 0.042 编号 绿原酸 松脂醇二 异绿原 1，5-二咖啡 羟基红花 人参皂 人参皂 评分
A 0.090 1 0.090 0.021 0.888 葡萄糖苷 酸A 酰奎宁酸 黄色素A 苷Rg1 苷Rb1
B 0.001 1 0.001 0 0.990 1 2.118 6 1.127 9 1.789 3 1.346 4 3.623 1 3.333 8 2.492 0 95.21
C 6.376 1 6.376 1.510 0.259 2 2.132 4 1.106 6 1.836 8 1.343 6 3.604 0 3.186 7 2.627 4 95.24
AB 3.062 1 3.062 0.725 0.423 3 2.092 0 1.103 4 1.857 5 1.354 0 3.620 8 3.394 4 2.569 5 96.04
AC 9.766 1 9.766 2.313 0.172 平均值 2.114 3 1.112 6 1.827 9 1.348 0 3.616 0 3.305 0 2.563 0 95.50
BC 1.674 1 1.674 0.397 0.549 2.6 MT-2提取物对破骨细胞分化影响的考察
A 2 34.580 1 34.580 8.190 0.024
B 2 15.445 1 15.445 3.658 0.097 2.6.1 细胞培养 将 RAW264.7 细胞接种于含有 1％青
C 2 66.788 1 66.788 15.818 0.005 霉素-链霉素双抗和10％胎牛血清的DMEM培养基中，
残差 29.555 7 4.222 于37 ℃、5％CO2培养箱中培养（培养条件下同）。
失拟项 28.360 3 9.453 31.629 0.003 2.6.2 MT-2 提取物药液的制备 按“2.5.3”项下最优工
纯误差 1.196 4 0.299
总和 179.568 16 艺提取MT-2，合并2次滤液，旋转蒸发挥去乙醇后，冷冻
干燥，即得 MT-2 提取物冻干粉（提取率为 27.0％）。取
98 综合评分
96 1∶16 冻干粉适量，用 DMEM 培养基溶解，经 0.45 μm 滤膜滤
综合评分 92 1∶15 过，取续滤液，即得。
94
90
88 （ g/mL ） 1∶14 2.6.3 MT-2 提 取 物 对 细 胞 增 殖 活 性 的 影 响 采 用
86 B/ CCK-8 法进行考察。取对数生长期的 RAW264.7 细胞，
84
1∶13
3
经消化后制成单细胞悬液，以5×10 个/孔接种至96孔板
1∶16 72 1∶12 中，待细胞完全贴壁后，将其分为实验组和对照组，每组
1∶14 56 40 56 72
1∶12 40
B/ （ g/mL ） A/％ A/％ 设置 6 个复孔。实验组细胞加入含不同质量浓度 MT-2
A.因素A与B
提取物（18.6、37.2、74.4、111.6、148.8、186.0 ng/mL，按
98 综合评分
96 120 MT-2冻干粉质量计，按“2.6.2”项下方法处理；剂量设置
综合评分 92 108 参考前期预实验结果）的DMEM培养基，对照组细胞加
94
90
88 C/min 96 入等体积的 DMEM 培养基，培养 48 h。弃去培养基，每
86 84 孔加入 CCK-8 试剂适量，使用酶标仪于 450 nm 波长下
84
72 检测各孔的光密度值。采用SPSS 22.0软件对数据进行
72
120 56 60
108 96 84 72 40 A/％ 统计分析；数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方
C/min 60 40 56 72
A/％ 差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验；检验水准α＝
B.因素A与C
98 综合评分 0.05。结果显示，当 MT-2 提取物的质量浓度低于 186.0
96 120 ng/mL时，其对细胞活性无明显影响（P＞0.05），故在后续
综合评分 92 108 实验中，MT-2提取物的质量浓度不宜高于148.8 ng/mL。
94
90
88 C/min 96 2.6.4 MT-2提取物对破骨细胞分化的影响 取处于对
86 84 数生长期的RAW264.7细胞，经消化后制成单细胞悬液，
84
72 3
以5×10 个/孔接种至96孔板中，待细胞完全贴壁后，将其
120 1∶14 1∶16 60 分为对照组、模型组和MT-2低、中、高质量浓度组，每组
108 96
84 72 60 1∶12 1∶12 1∶13 1∶14 1∶15 1∶16
C/min B/ （ g/mL ） B/（g/mL） 设置6个复孔。除对照组外，其余各组均加入100 ng/mL
C.因素B与C
RANKL诱导以制备破骨细胞分化模型，同时各药物组加
图3 因素A、B、C对综合评分影响的3D响应面图与等
入含不同质量浓度MT-2提取物（18.6、37.2、74.4 ng/mL，
高线图
按 MT-2 冻干粉质量计；剂量设置参考前期预实验和
2.5.3 最优工艺及验证 采用 Design Expert 8.0.6 软件 “2.6.3”项下结果）的DMEM培养基，对照组和模型组细
求解上述多元二次方程，得 MT-2 最优提取工艺为乙醇 胞加入等体积的DMEM培养基。培养5 d后，每孔用磷
体 积 分 数 59.78％ ，料 液 比 1 ∶ 14.03，提 取 时 间 93.48 酸盐缓冲液冲洗 3 次，用多聚甲醛固定 30 min 后，再用
min。考虑到实际的可操作性，最终将工艺参数调整为 磷酸盐缓冲液冲洗3次。参照TRAP染色试剂盒说明书
乙醇体积分数60％，料液比1∶14，提取时间94 min，提取 配制染液并染色，于荧光显微镜下观察。以TRAP染色
2 次。根据上述最优条件，进行3次验证实验，结果见表 阳性的多核细胞（细胞核≥3）为破骨细胞，观察各组破
5。由表 5 可知，3 次验证实验的平均综合评分为 95.50， 骨细胞的分化情况。结果（图 4A～图 4E）显示，对照组
与预测值（95.75）的相对误差为－0.26％，表明该方法重 未见明显染色区域，细胞数量少；模型组出现散在的大
现性好，工艺稳定。 型细胞，且 TRAP 染色呈阳性，可见多核细胞，即存在

中国药房 2022年第33卷第16期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 16 ·1947 ·