Page 30 - 《中国药房》2022年16期
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因素对提取工艺的影响；同时，拟通过破骨细胞模型来                            交集的韦恩图，共获得交集靶点470个。采用CytoScape
        验证最优工艺所得提取物对破骨细胞分化的抑制活性，                            软件绘制方中活性化合物与 470 个交集靶点的网络图，
        以期克服既往研究成分与疗效脱节的不足，为建立                              计算各成分与交集靶点的关联度（即度值）。使用Cyto-
        MT-2规范化生产工艺提供可靠的实验依据。                               Scape 软件的“Network Analyzer”功能对网络图进行分
        1 材料                                                析，明确与交集靶点有相互作用的活性成分。结果显
        1.1 主要仪器                                            示，人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、1，5-二咖啡酰奎宁酸、
            本研究所用主要仪器包括 LC-2030C 3D 型高效液                    异绿原酸A、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、羟基红花黄色
        相色谱仪（日本Shimadzu公司）、Heraeus HERAcell 150i            素A均能与20个以上的交集靶点相互作用，其度值分别
        型细胞培养箱（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）、             为73、58、64、63、55、55、50。因此，初步确定以上成分为
        Spectra Max i3x 型酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公                  MT-2提取工艺评价的候选指标性成分。
        司]、DMi8型倒置荧光显微镜（德国Leica公司）等。                        2.1.2  实验验证     本课题组在预实验中采用反相高效
        1.2 主要药品与试剂                                         液相色谱法对各单味药材中的成分进行了测定，发现上
            蒙药蓝刺头药材于 2020 年 8 月采自内蒙古呼和浩                     述方法无法对珍珠的有效成分（氨基酸类成分）进行有
        特市武川县，经内蒙古医科大学药学院薛培凤教授鉴定                            效定量，若采用柱前衍生化的方法，则会影响其余药材
        为菊科植物驴欺口 Echinops latifolius Tausch.的干燥花            中有效成分的准确测定。结合“2.1.1”项下结果，氨基酸
        序。杜仲、红花药材和三七粉均购自亳州抱朴药业有限                            类成分对骨质疏松的干预并不明显，故本研究最终确定
        责任公司，珍珠购自北京同仁堂股份有限公司，经内蒙                            将绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、异绿原酸 A、1，5-二咖啡
        古医科大学药学院薛培凤教授鉴定均为真品。                                酰奎宁酸、羟基红花黄色素A、人参皂苷Rg1和人参皂苷
            绿原酸对照品（批号 SH18071907，纯度≥98.0％）、                 Rb1作为MT-2提取工艺优化的指标性成分。
        松脂醇二葡萄糖苷对照品（批号 SH19102403，纯度≥                       2.2  7种指标性成分含量测定方法的建立
        98.0％）、异绿原酸 A 对照品（批号 SH20092505，纯度≥                 2.2.1  色谱条件       以 Thermo Hypersil GOLD C18 （4.6
        98.0％）、1，5-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号SH20200429，                 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇（A）-0.1％甲酸溶
        纯 度 ≥98.0％）、羟 基 红 花 黄 色 素 A 对 照 品（批 号               液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～5 min，2％A→5％A；
        SH19082807，纯度≥98.0％）、人参皂苷Rg1对照品（批号                  5～10 min，5％A→10％A；10～15 min，10％A→18％A；
        SH19040208，纯度≥98.0％）、人参皂苷Rb1对照品（批号                  15～25 min，18％A→23％A；25～35 min，23％A→28％A；
        SH19012107，纯度≥98.0％）均购自北京赛百草科技有                     35～65 min，28％A→33％A；65～70 min，33％A→39％A；
        限公司。                                                70～75 min，39％A→100％A）；柱温为30 ℃；流速为0.6
            核因子κB 受体激活蛋白配体（receptor activator of            mL/min；检测波长为 203 nm（人参皂苷 Rb1、人参皂苷
        nuclear factor-κB ligand，RANKL）购自美国R&D System       Rg1 ）、277 nm（绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、异绿原酸A、
        公司；TRAP 染色试剂盒购自美国 Sigma-Aldrich 公司；                 1，5-二咖啡酰奎宁酸）、403 nm（羟基红花黄色素 A）；进
        DMEM 培养基和胎牛血清均购自美国 Gibco 公司；                        样量为10 µL。
        CCK-8试剂盒购自日本DOJINDO公司。其余试剂包括                        2.2.2  混合对照品溶液的制备           精密称取绿原酸、松脂
        甲醇（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）、甲酸（分析纯）等，水                        醇二葡萄糖苷、异绿原酸 A、1，5-二咖啡酰奎宁酸、羟基
        为纯净水。                                               红花黄色素 A、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1 对照品各
        1.3  细胞                                             10.00、10.54、10.90、10.31、10.20、10.20、10.10 mg，分别置
            小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7 购自中国科学院细                      于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，即得各单一
        胞库。                                                 对照品溶液。分别吸取上述 7 种单一对照品溶液 830、
        2 方法与结果                                             370、640、540、1 375、135、1 110 μL，置于同一10 mL量瓶
        2.1 指标性成分的确定                                        中，加入甲醇定容，摇匀，配制成上述成分质量浓度分别
        2.1.1  网络药理学筛选          以 TCMSP 数据库（http：//tc-      为 0.083、0.039、0.070、0.056、0.140、0.014、0.112 mg/mL
        mspw.com/tcmsp.php）、SymMap 数 据 库（https：//www.       的混合对照品溶液。
        symmap.org）和 ETCM 数 据 库（http：//www.nrc.ac.cn：       2.2.3  供试品溶液的制备          取杜仲、蓝刺头和红花药
        9090/ETCM）为依据，检索 MT-2 各药材所含化合物，经                    材，于 50 ℃下干燥 2 h，粉碎，过 40 目筛，得实验用药材
        活性靶点筛选、去重后，共得到方中活性化合物257个、                          粉末。取杜仲粉末、蓝刺头粉末、红花粉末、三七粉、珍
        对应靶点 931 个。借助 DisGeNET 数据库（https：//www.             珠粉各1.6、1.2、0.8、0.4、0.1 g，精密称定，置250 mL圆底
        disgenet.org）筛选骨质疏松相关基因，共获得该疾病相                     烧瓶中，按不同料液比加入不同体积分数的乙醇进行不
        关基因3 704个。采用Venny 2.1.0在线工具（https：//bio-            同次数、不同时间的回流提取，滤过（由于三七、珍珠为极
        infogp.cnb.csic.es/tools/venny）绘制成分靶点与疾病靶点          细粉，为避免其在提取中的损失，2味药均在末次回流时


        ·1944 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 16                                 中国药房    2022年第33卷第16期
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