Page 21 - 《中国药房》2022年16期
P. 21

化合物 11：白色无定形粉末，HR-ESI-MS 显示 m/z                密度（optical density，OD）。细胞存活率（％）＝给药组
                         +
        为 283.165 1[M+Na]（计算值 283.167 4，C17H24NaO2 ），推     平均 OD 值/空白组平均 OD 值×100％。结果显示，4 个
                                      1
        测化合物的分子式为 C17H24O2。 H-NMR（CDCl3，600                炔醇类化合物均对RAW264.7细胞无细胞毒作用。
        MHz）显示 5 个烯氢质子信号：δ H 6.34（1H，dd，J＝15.6、            2.3.3 NO 含量测定       用 Griess 法进行检测。将 RAW
        5.4 Hz，H-9），5.96（1H，ddd，J＝17.4、10.2、5.4 Hz，H-2），   264.7细胞置于96孔板中，调整细胞密度为5×10 个/孔，
                                                                                                     4
        5.77（1H，d，J＝15.6 Hz，H-8），5.48（1H，br d，J＝17.0 Hz，   设置空白组、模型组和给药组，给药和造模同时进行（给
        H-1b），5.27（1H，br d，J＝10.2 Hz，H-1a）；2 个连氧次甲         药剂量和造模剂量依据预实验结果设置）。培养24 h后
        基信号：δ H 4.98（1H，d，J＝5.4 Hz，H-3），4.20（1H，m，         弃上清液，空白组加入无血清DMEM培养基，模型组加
        H-10）；1 个末端甲基信号：δ H 0.88（3H，t，J＝7.2 Hz，            入含脂多糖（1 μg/mL）的无血清 DMEM 培养基，给药组
        H3-17）；1 组 脂 肪 族 链 信 号 ：δ H 1.28～1.64（12H，m，       加入用无血清DMEM培养基配制的含不同浓度的炔醇
                     13
        H-11～H-16）。 C-NMR（CDCl3，150 MHz）中δ C：117.4         类化合物（3.13、6.25、12.5、25.0、50.0 μmol/L）和脂多糖
       （C-1），136.0（C-2），63.8（C-3），80.5（C-4），73.6（C-5），     （1 μg/mL），每孔 100 μL，每组设置 3 个复孔。培养 24 h
        71.0（C-6），77.6（C-7），108.1（C-8），150.1（C-9），72.1     后取细胞上清液在 540 nm 波长处测定 OD 值从而计算
       （C-10），37.0（C-11），25.3（C-12），29.3（C-13），29.5        NO 的含量。除化合物 10 以外，其他 3 种炔醇类化合物
       （C-14），22.7（C-15），31.9（C-16），14.2（C-17）。以上数据        对NO含量均无降低作用。与模型组相比，化合物10在
        与文献[16]报道的heptadeca-1，8-dien-4，6-diyne-3，10-diol   给药浓度为 12.5、25.0、50.0 μmol/L 时，可显著逆转脂多
        一致。                                                糖诱导的细胞上清液中NO含量的升高（P＜0.05或P＜
            化 合 物 12：无 色 油 状 物 。 ESI-MS 显 示 m/z 为          0.01）。结果见表1。
        245.24[M+H] ，综合其 1D-NMR 数据分析，推测其分子                 表1    化合物10对RAW 264.7细胞上清液中NO含量的
                   +
                    1
        式为 C17H24O。 H-NMR（CDCl3，600 MHz）显示 5 个烯氢                 影响（x±±s，μmol/L，n＝3）
        质子信号：δ H 5.94（1H，ddd，J＝17.4、10.2、5.4 Hz，H-2），       组别（给药浓度）       NO含量     组别（给药浓度）       NO含量
        5.51（1H，m，H-10），5.47（1H，d，J＝17.4 Hz，H-1a），5.37      空白组            1.93±0.65  给药组（12.5 μmol/L）  19.73±2.76 b
                                                            模型组           27.49±1.89 a  给药组（25.0 μmol/L）  15.71±4.88 b
       （1H，m，H-9），5.24（1H，d，J＝10.2 Hz，H-1b）；1 个连氧
                                                            给药组（3.13 μmol/L）  23.53±2.75  给药组（50.0 μmol/L）  7.21±1.71 c
        次甲基信号：δ H 4.91（1H，d，J＝4.8 Hz，H-3）；1个与双键             给药组（6.25 μmol/L）  23.58±4.07
        相连的亚甲基信号：3.03（2H，d，J＝7.2 Hz，H2-8）；1个末                  a：与空白组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组
        端甲基信号：δH 0.88（3H，t，J＝6.6 Hz，H3-17）。 C-NMR          比较，P＜0.01
                                                13
       （CDCl3，150 MHz）中δ C：117.1（C-1），136.2（C-2），63.7      2.3.4 COX-2 蛋白表达测定         采用 Western blot 法进行
       （C-3），74.3（C-4），71.4（C-5），64.1（C-6），80.4（C-7），17.8  测定。将RAW 264.7细胞接种于6孔板中，设置空白组、
       （C-8），122.0（C-9），133.2（C-10），27.3（C-11），29.3        模型组和给药组，给药和造模同时进行（给药剂量和造
       （C-12），29.3（C-13），29.3（C-14），31.9（C-15），22.8        模剂量依据“2.3.3”项下结果设置）。培养 24 h 后，空白
       （C-16），14.2（C-17）。以上数据与文献[15]报道的人参                  组加入不含药的 DMEM 培养基，模型组加入脂多糖
        炔醇一致。                                              （1 μg/mL），给药组加入不同浓度的化合物 10（12.5、
        2.3  炔醇类成分的抗炎活性研究                                  25.0、50.0 μmol/L）和脂多糖（1 μg/mL），每组设置3个复
        2.3.1  统计分析方法       实验结果以SPSS 21.0软件进行             孔。培养 24 h 后，于冰盒上将上清液吸出，用 PBS 清洗
        统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因                          细胞，加入RIPA裂解液处理30 min，以12 000 r/min离心
        素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准                       15 min后检测蛋白浓度。将蛋白高温变性后，用十二烷
        α＝0.05。                                            基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转至聚偏二
        2.3.2  细胞活力测定       用 CCK-8 法进行检测。为防止              氟乙烯膜上，取出，用5％脱脂牛奶封闭2 h，在4 ℃环境
        药物因具有细胞毒作用导致细胞死亡而产生假阳性结                            下与β-actin抗体（稀释比例为1 ∶ 3 000）、COX-2抗体（稀
        果，对药物是否具有杀死 RAW264.7 细胞的作用进行考                      释比例为 1 ∶ 5 000）共同孵育过夜；用 TBST 洗涤 3 次后
        察。将RAW264.7细胞置于96孔板中，调整细胞密度为                       将聚偏二氟乙烯膜与辣根过氧化物酶标记二抗（稀释比
        5×10 个/孔，设置空白组和给药组。在 37 ℃、5％CO2条                   例为1 ∶ 5 000）在37 ℃孵育2 h，再用TBST洗涤3次后用
            4
        件下（后同）培养 24 h，弃上清液，给药组加入用无血清                       显影仪检测相应的蛋白条带。用Image J 1.8.0 软件分析
        DMEM 培养基配制的含炔醇类化合物（化合物 9～12）                       各条带灰度值，以COX-2蛋白与β-actin蛋白灰度值的比
        的药液，浓度分别为 1.56、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0            值作为 COX-2 蛋白表达量。结果见图 1。与空白组比
        μmol/L，空白组加入无血清DMEM培养基，每孔100 μL，                   较，模型组COX-2蛋白表达量升高（P＜0.01）；与模型组
        每组设置3个复孔。培养24 h后，每孔加入CCK-8试剂                       比较，化合物 10 在给药浓度为 50.0 μmol/L 时能显著降
        10 μL，培养1 h后用酶标仪测定450 nm波长处各孔的光                    低细胞中COX-2蛋白表达量（P＜0.05）。


        中国药房    2022年第33卷第16期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 16  ·1935 ·
   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26