Page 64 - 《中国药房》2022年15期
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2.3 大鼠血清中Cr、BUN水平的检测                                          表1 引物序列及扩增产物长度
            取“2.2”项下血清样品，采用分光光度法检测各组大                       基因       引物序列                         扩增产物长度/bp
        鼠血清中 Cr、BUN 的水平，并计算 BUN/Cr 的比值以评                    TGF-β1   上游：5′-GCTGAACCAAGGAGACGGAATA-3′  194
                                                                     下游：5′-GCAGGTGTTGAGCCCTTTCC-3′
        价肾脏功能。
                                                            Smad2    上游：5′-GTTTGCCGAGTGCCTAAGTGATA-3′  258
        2.4 大鼠肾脏系数的检测                                                下游：5′-ACTGTCTGCCTCCGGTATTCTG-3′
            统计大鼠体质量与肾脏质量，计算肾脏系数（肾脏                          Smad3    上游：5′-CGAGAACACTAACTTCCCCGCT-3′  112
        系数＝肾脏质量/体质量），以此来评价肾脏的病变程度。                                   下游：5′-GTGGTTCATCTGGTGGTCGCTA-3′
                                                            ERK1     上游：5′-GAGAGATGTTTACATTGTTCAGGACC-3′  273
        2.5 大鼠肾脏组织的病理形态学观察                                           下游：5′-GCCACATACTCGGTAAGAAAGC-3′
            取 4％多聚甲醛固定的肾脏组织适量，经梯度乙醇                         ERK2     上游：5′-AACCTCCTGCTGAACACCACT-3′  111
        脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度为4 μm）等过程                                 下游：5′-CGTGGCTACATACTCTGTCAAGAAC-3′
                                                            GAPDH    上游：5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′  138
        制作病理切片。切片经二甲苯脱蜡后，一部分切片经苏
                                                                     下游：5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′
        木素-伊红（HE）染色，于光学显微镜下观察肾组织病理
                                                            2.8 统计学方法
        学变化。一部分切片（剩余部分用于后续相关蛋白表达
                                                                数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析。实验结果
        水平的检测）经 Masson 染色（其中肌纤维呈红色，胶原
                                                            满足正态分布以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
        纤维呈蓝绿色），于光学显微镜（×400）下随机选取 1 个
                                                            分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α＝0.05。
        视野，以蓝绿色为阳性染色，采用 Image-Pro Plus 6.0 软
                                                            3 结果
        件测定每个视野下蓝绿色阳性面积与总面积，计算阳性
                                                            3.1 大鼠肾脏外观形态的观察结果
        面积百分比。
                                                                正常组大鼠肾脏形态完整，色泽红润且表面光滑。
        2.6  大鼠肾脏组织中 TGF-β 1介导的 Smads 和 ERK 通
        路相关蛋白表达水平的检测                                        模型组大鼠肾脏体积明显增大，表面颗粒化严重，颜色
                                                            灰白且缺血；剖开后可见肾内有大量积液潴留，肾皮质
            采用免疫组织化学法进行检测。取“2.5”项下石蜡
        切片经二甲苯脱蜡、水化后，以H2O2封闭，再以磷酸盐缓                         明显变薄，皮髓质界限不清晰。秋水仙碱片组和金匮肾
        冲液清洗，柠檬酸盐缓冲液热修复8 min；滴加山羊血清                         气丸各剂量组大鼠肾脏表面色泽较模型组稍显红润，但
        封闭液，室温孵育 30 min，倾去液体，分别滴加 TGF-β 1、                  仍呈缺血状态，表面颗粒化程度改善不明显（图略）。
        Smad2、Smad3、ERK1、ERK2 一抗（稀释度均为 1 ∶ 200），            3.2  大鼠血清中 Cr、BUN 水平及 BUN/Cr 比值的测定
        4 ℃孵育过夜；滴加生物素标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵                         结果
        育20 min，DAB显色10 min，用自来水冲洗后，经苏木素                        与正常组比较，模型组大鼠血清中Cr、BUN水平均
        复染 3 min，用盐酸乙醇分化，并用自来水再次冲洗；切                        显著升高（P＜0.05），BUN/Cr 比值显著降低（P＜0.05）。
        片经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后，采用                           与模型组比较，秋水仙碱片组和金匮肾气丸各剂量组大
        光学显微镜进行观察。每只大鼠肾脏切片在光学显微                             鼠血清中 Cr、BUN 水平均显著降低（P＜0.05），BUN/Cr
        镜（×400）下随机选取 1 个视野，以棕黄色为阳性染色，                       比值均显著升高（P＜0.05）。结果见表2。
        采用 Image-Pro Plus 6.0 软件测定每个视野中阳性染色                 表2   各组大鼠血清中Cr、BUN水平及BUN/Cr的测定
        区域的积分光密度（integrated optical density，IOD）值，               结果（x±±s，n＝10）
        用来反映目的蛋白的表达情况。                                      组别            Cr/（μmol/L）  BUN/（mmol/L）  BUN/Cr
        2.7  大鼠肾脏组织中 TGF-β 1介导的 Smads 和 ERK 通               正常组           240.49±33.38  39.35±4.88  40.82±8.68
        路相关mRNA表达水平的检测                                      模型组           646.59±75.37 a  53.98±8.59 a  20.59±3.78 a
                                                            秋水仙碱片组        169.47±36.30 b  45.31±2.62 b  33.85±7.09 b
            采用实时荧光定量PCR法进行检测。根据GenBank                      金匮肾气丸低剂量组     313.98±61.35 b  49.66±6.43 b  35.75±7.31 b
        （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）已发表的大鼠 TGF-β 1、       金匮肾气丸中剂量组     271.17±40.17 b  39.58±5.73 b  33.79±6.23 b
        Smad2、Smad3、ERK1、ERK2 基因序列设计特异性引物                   金匮肾气丸高剂量组     261.68±19.78 b  47.15±8.79 b  44.70±8.54 b
        （引物序列及扩增产物长度见表 1），以上引物由武汉                              a：与正常组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
        塞维尔生物科技有限公司合成。取肾脏组织100 mg，加                         3.3 大鼠肾脏系数的测定结果
        入 1 mL TriQuick 试剂充分研磨匀浆后提取总 RNA，检                      正常组、模型组、秋水仙碱片组和金匮肾气丸低、
                                                                                                         －3
        测 RNA 浓度及纯度。取总 RNA 适量，在 20 μL 反应体                   中、高剂量组大鼠肾脏系数分别为（6.89±0.28）×10 、
        系中合成cDNA，再以2 μL cDNA为模板，加入靶基因的                     （37.16 ± 5.61）× 10  － 3 、（20.77 ± 2.62）× 10  － 3 、（33.59 ±
                                                                    －3
                                                                                      －3
                                                                                                         －3
        上、下游引物于15 μL反应体系中进行PCR扩增。反应                         7.31）×10 、（29.11±5.12）×10 、（22.30±3.72）×10 。
        结束后，根据扩增曲线及溶解曲线判断PCR反应的特异                           与正常组比较，模型组大鼠肾脏系数显著升高（P＜
        性。所得结果以GAPDH为内参，采用2               －ΔΔCt 法计算目的       0.05）；与模型组比较，秋水仙碱片组和金匮肾气丸中、高
        基因的相对表达水平。                                          剂量组大鼠肾脏系数均显著降低（P＜0.05）。


        ·1850 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 15                                 中国药房    2022年第33卷第15期
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