Page 38 - 《中国药房》2022年14期
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1.3 动物                                              提 RNA，逆转录合成 cDNA，然后取 1 μL 逆转录产物进
            SPF级雄性昆明种小鼠，100只，体质量18～22 g，由                   行PCR检测。PCR的反应总体系为Takara SYBR Premix
        贵州医科大学实验动物中心提供，生产许可证号为                              Ex Tap 10 μL，上下游引物（20 μmol/L）各 0.2 μL，cDNA
        SCXK（黔）2018-0001。小鼠饲养环境通风良好，温度                      2 μL，用ddH2O补至20 μL。反应条件如下：95 ℃预变性
        18～25 ℃，相对湿度 40％～70％，12 h/12 h 光照昼夜循                2 min；95 ℃变性 5 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共
        环。本实验通过贵州医科大学实验动物伦理委员会审                             40个循环。以GAPDH为参照，采用2             －ΔΔCt 法计算各组小
        批（编号2000069）。                                       鼠肝组织中XOD mRNA的相对表达量。引物序列和产
        2 方法                                                物长度见表1。
        2.1 WCS与ECS的制备                                                表1 PCR引物序列和产物长度
            分别称取金雀花根2 kg，加16 L水煎煮提取或16 L                     基因                 引物序列                产物长度/bp
                                                             XOD       上游引物：5′-GGAGACAGTAACGCCAAACAGC-3′  219
        75％乙醇回流提取，均提取2 h，再同法提取1 h，过滤，合
                                                                       下游引物：5′-CCTCACGGACCAGGATTTACAG-3′
        并相应的滤液，减压浓缩为浸膏，得 WCS 400 g、ECS                       GAPDH     上游引物：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′  219
        519 g，备用。                                                      下游引物：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′
        2.2 分组、建模与给药                                        2.6  肝组织中 XOD 蛋白和肾组织中 GLUT9、URAT1、
            小鼠适应性饲养 1 周后，按体质量随机分为正常对                        OAT1蛋白表达检测
                                              [7]
        照组、模型组、别嘌醇组（阳性对照，5 mg/kg ）、苯溴马                          采用 Western blot 法检测。分别称取各组 3 只小鼠
                                [8]
        隆组（阳性对照，7.8 mg/kg ）和 WCS 低、中、高剂量组                   的冻存肝组织与肾组织样本各 100 mg，加 RIPA 组织裂
        （38、75、150 mg/kg，根据临床常用剂量的 0.5、1、2 倍换               解液1 mL，于冰上研磨成匀浆，于4 ℃以12 000 r/min离
        算）以及ECS低、中、高剂量组（50、100、200 mg/kg，根据                 心 10 min，取上清液，采用 BCA 法测定蛋白浓度。取蛋
        临床常用剂量的0.5、1、2倍换算），每组10只。除正常对                       白终浓度为1 μg/μL的样本上样15 μL，加入5×蛋白上样
        照组小鼠腹腔注射和灌胃等体积生理盐水外，其余各组                            缓冲液，于100 ℃加热5 min变性，然后进行10％十二烷
        小鼠于每天早上 9：00 腹腔注射氧嗪酸钾 100 mg/kg 联                   基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V 电泳至 Marker 红
        合 灌 胃 次 黄 嘌 呤 500 mg/kg，连 续 7 d，建 立 HUA 模           色条带出现，转换电压 120 V 至电泳结束。采用湿转法
          [7]
        型 。从建模第 3 天起，各给药组小鼠于建模给药后 1 h                       将蛋白转到 PVDF 膜上，用 5％脱脂奶粉将膜在室温下
        分别灌胃相应药物，正常对照组和模型组小鼠灌胃等体                            封闭 1.5 h，用 TBST 缓冲液清洗 3 次，每次 10 min，分别
        积生理盐水，每日1次，连续5 d。                                   加入 XOD、GLUT9、URAT1、OAT1、GAPDH 一抗（目
        2.3  取样与体质量、脏器指数分析                                  标蛋白稀释比例均为 1 ∶ 1 000，内参蛋白稀释比例均
            分别称定各组小鼠建模给药第 1、3、5、7 天的体质                      为 1 ∶ 3 000），4℃孵育过夜；用TBST缓冲液清洗3 次，每
        量。末次给药前，禁食不禁水24 h，末次给药1 h后小鼠                        次 10 min，加入二抗（稀释比例为 1 ∶ 3 000），室温孵育 1
        眼眶取血，室温静置2 h，以3 500 r/min离心15 min，取血                h，用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，显影成像。采
        清，于－20 ℃中保存备用。采血后脱颈椎处死小鼠，剖                          用 Image J 1.8.0 软件分析条带的灰度值，以目标蛋白灰
        取内脏，称定质量，计算肝、肾和脾的脏器指数[脏器指                           度值与内参蛋白（GAPDH）灰度值的比值评价蛋白的相
        数＝脏器质量（g）/体质量（g）×100％]。然后快速将一部                      对表达量。
        分肾组织固定于 4％多聚甲醛中保存备用，另一部分肾                           2.7 肾组织病理学观察
        组织与肝组织于－80 ℃中保存备用。                                      取 4％多聚甲醛固定的肾组织，乙醇脱水、石蜡包
        2.4 血清中生化指标和肝组织中XOD活性检测                             埋、切片，经苏木精-伊红染色后，于正置光学显微镜下
            取各组小鼠血清适量，按照试剂盒说明书操作，检                          观察肾组织的病理学变化。
        测 XOD 活性和 SUA、BUN、血肌酐（serum creatinine，             2.8 统计学分析
        SCR）含量。另取各组小鼠肝组织 100 mg，加入生理盐                           所有数据均用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，数据
        水制成 10％的匀浆液，以 2 500 r/min 离心 10 min，取上              以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
        清液，按照试剂盒说明书操作，检测XOD活性。                              两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
        2.5  肝组织中XOD mRNA表达检测                               3 结果
            采 用 实 时 定 量 聚 合 酶 链 反 应（polymerase chain        3.1 WCS和ECS对HUA模型小鼠体质量的影响
        reaction，PCR）法检测。取各组3只小鼠的冻存肝组织，                         如表2所示，与正常对照组比较，别嘌醇组小鼠建模
        研磨后，转移至 1.5 mL 预冷的 EP 管中，裂解组织后，抽                    给药第3、5、7天的体质量均显著降低（P＜0.01），其余各


        ·1696 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 14                                 中国药房    2022年第33卷第14期
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