Page 66 - 《中国药房》2022年13期

谱仪测定RBC和FA-RBC的结构。 2.9 细胞摄取实验
2.4 DOX-CS-NPs的制备与表征 取对数生长期的MCF-7细胞，以1×10 个/孔接种至
4
采用离子交联法制备 DOX-CS-NPs 。在 25 ℃、 96 孔板中，于 37 ℃、5％CO2条件下培养 24 h 后，弃去原
[13]
400 r/min 的磁力搅拌下，于壳聚糖醋酸溶液（pH6.0）中 培 养 基 ，分 别 加 入 含 DOX、FA-RBC-DOX-CS-NPs 和
加入DOX溶液，缓慢滴加三聚磷酸钠溶液至产生乳光， FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs（游离 FA 用于封闭受体以验
继续磁力搅拌10 min得纳米粒混悬液；将纳米粒混悬液 证纳米粒的入胞作用是否由 FA 受体介导）的新鲜培养
置 于 超 滤 管（100 kDa）中 离 心（4 000 r/min），即 得 基（以 DOX 计，质量浓度均为 5 μg/mL）；另设不加药物
DOX-CS-NPs。其中，DOX溶液、壳聚糖醋酸溶液、三聚 的空白组。于培养1、4 h时移除培养基，以4％多聚甲醛
磷酸钠溶液的质量浓度分别0.5、1.5、0.4 mg/mL，体积比 固定 30 min；以 PBS 洗涤后，用 10 µg/mL 的 DAPI 染色
为 5 ∶ 5 ∶ 4。采用激光纳米粒径仪测定该纳米粒的粒径、 1 h，采用共聚焦显微镜观察细胞的摄取情况。
多分散性指数（polydisepersity index，PDI）和Zeta电位。 3 结果与分析
2.5 DOX-CS-NPs包封率和载药量的测定 3.1 FA-PEG2000-DSPE的合成结果
取适量DOX（质量记为M）按“2.4”项下方法制备纳
FA、NH2-PEG2000-DSPE 和 FA-PEG2000-DSPE 的
米粒混悬液并超滤，取下清液，采用紫外可见分光光度 1 H-NMR 如图 2～图 4 所示。对比图谱可知，图 4 中
计测定其中 DOX 含量（记为 M1 ） 。取超滤膜上纳米
[14]
7.73～7.55 ppm（e）和6.75～6.49 ppm（f）位置的2个峰分
粒，冻干，称质量（记为M2 ）。计算包封率和载药量，具体
别对应FA苯环上的H原子；8.11 ppm（d）和6.94 ppm（g）
公式如下：包封率（％）＝（M－M1 ）/M×100％，载药量
位置的 2 个峰分别对应 FA 上—NH—基团的 H 原子；
（％）＝（M－M1 ）/M2×100％。
4.33 ppm（b）、4.49 ppm（h）、8.65 ppm（i）位置的峰也与
2.6 FA-RBC-DOX-CS-NPs的制备及表征
1
FA的 H-NMR相符；3.51 ppm和1.24 ppm位置的峰分别
采用细胞破碎仪处理FA-RBC（功率100 W，先破碎
属 于 NH2-PEG2000-DSPE 中 —C17H35、—OCH2CH2— 基
4 s，间隔 5 s 后，再破碎 5 s），将破碎后的 FA-RBC 和
团上的H原子。由此表明，载体材料FA-PEG2000-DSPE
DOX-CS-NPs 经 400 nm 聚碳酸酯膜挤压 3 次后，再经
合成成功。
200 nm 聚 碳 酸 酯 膜 挤 压 5 次 ，即 得 FA-RBC-DOX-
CS-NPs。采用激光纳米粒径仪测定其粒径、PDI 和Zeta 14 000
13 000
电位。 12 000
11 000
2.7 体外释放特性考察 10 000
9 000
分 别 取 适 量 DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBC-DOX- 8 000
7 000
CS-NPs 置于不同透析袋中，再将各透析袋分别置于 pH 6 000 吸收强度
5 000
7.4（模拟体循环环境）和pH6.5（模拟肿瘤微环境）的PBS 4 000
3 000
溶液（释放介质）中，于 37 ℃、100 r/min 摇床上进行透 2 000
1 000
析。在预定的时间点（1、2、4、8、12、24、48、72 h），取出 0
－1 000
10 mL释放介质并补充等量新鲜介质，按“2.5”项下紫外
20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2
分光光度法测定取出的释放介质中DOX的含量，并计算 δ/ppm
1
累积释放率。 图2 FA的 H-NMR图
2.8 体外抗肿瘤活性考察
4
取对数生长期的MCF-7细胞，以1×10 个/孔接种至 3 400
96 孔板中，于 37 ℃、5％CO2条件下培养 24 h 后，弃去原 3 000
培 养 基 ，分 别 加 入 含 DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBC- 2 600
2 200
DOX-CS-NPs 的培养基（以 DOX 计，质量浓度均分别为
1 800
0.001、0.010、0.100、0.500、1.000、5.000 μ g/mL），每 孔 1 400 吸收强度
100 µL，各浓度平行 5 份；另设对照组（只加细胞不加药 1 000
物）。培养 48 h 后，加入 10 µL MTT（5 mg/mL），继续培 600
养 4 h；吸出培养基，加入 DMSO 150 µL，采用酶标仪于 200 0
－200
570 nm波长处测定各孔光密度（optical density，OD）值，
6.6 6.2 5.8 5.4 5.0 4.6 4.2 3.8 3.4 3.0 2.6 2.2 1.8 1.4 1.0 0.6
并计算细胞存活率，细胞存活率（％）＝（给药组平均OD δ/ppm
值/对照组平均OD值）×100％。 图3 NH2-PEG2000-DSPE的 H-NMR图
1

·1596 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 13 中国药房 2022年第33卷第13期