Page 45 - 《中国药房》2022年13期

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组金黄地鼠全程给予高糖高脂饲料喂养 。饲养 6 周 2.8 心 肌 组 织 NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κ B、
后，造模组金黄地鼠连续 3 d 腹腔注射 STZ（溶于 pH4.5 IL-1β mRNA表达水平检测
的柠檬酸钠缓冲液中）30 mg/kg，对照组金黄地鼠腹腔注 采用PCR法检测。称取“2.2”项下心肌组织50 mg，
射相同体积的柠檬酸钠缓冲液。STZ 注射 3 d 后，通过 经液氮研磨后，加入 RNA 裂解液、无水乙醇，以 10 000
尾静脉采血检测金黄地鼠的血糖，血糖＞16.7 mmol/L r/min 于 4 ℃离心 10 min；加入现配制的 DNA 酶孵育液
视为成功诱导糖尿病，继续饲养 4 周使其自然发展为 50 μL，室温静置15 min，加入RNA洗液600 μL，以10 000
DCM 。将造模成功的 34 只 DCM 模型金黄地鼠随机 r/min 室温离心 1 min。逆转录采用两步法反应程序，
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分为模型组（9只）、中药高剂量组（8只）、中药低剂量组 预变性 95 ℃ 10 min，44 个循环反应：95 ℃ 15 s，60 ℃
（8只）、恩格列净组（9只，阳性对照）。对照组和模型组 60 s。扩增完毕后，得到各样本各目的基因及内参基因
金黄地鼠灌胃生理盐水。参照文献[7，11]，中药高剂量 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的量化周期（quantifica-
组金黄地鼠灌胃养心定悸胶囊 2 g/（kg·d），中药低剂量 tion cycle，Cq）值，ΔCq＝目的基因Cq值－内参Cq值；定
组金黄地鼠灌胃养心定悸胶囊 1 g/（kg·d），恩格列净组 量（quantification，Q）＝2 －ΔCq ，得到每个目的基因的 Q 值
金黄地鼠灌胃恩格列净 10 mg/（kg·d），药物均溶解于 及Q均值，各目的基因表达的相对定量（RQ）值＝每个目
0.9％ NaCl 溶液中。所有金黄地鼠每日灌胃 1 次，连续 的基因的 Q 值/Q 均值；将 RQ 值用于统计分析，得到
灌胃8周。 mRNA 表达水平。PCR 引物由生工生物工程（上海）股
2.2 取材与处理 份有限公司合成，PCR引物序列及产物长度见表1。
金黄地鼠灌胃 8 周后，取尾部血用于后续实验。然 表1 PCR引物序列及产物长度
后，禁食不禁水12 h，金黄地鼠吸入异氟烷麻醉，并进行 基因 引物序列 产物长度/bp
股动脉取血，以 4 000 r/min 于－4 ℃离心 10 min 分离血 GAPDH 上游引物：5′-TGAACGGGAAGCTCACTGGC-3′ 70
下游引物：5′-CATGTGAGATCCACGACGGACA-3′
清，置于－80 ℃冰箱以备后续实验。同时迅速取出金黄 NLRP3 上游引物：5′-CAGAGACTATGGTTGGGGCG-3′ 196
地鼠心脏并用冰生理盐水冲洗，排出残余血液并分离周 下游引物：5′-CTCCGATGTAGAGTCAAAGTTTCTG-3′
围组织。将心脏沿纵轴切割分离，一部分心肌组织放入 caspase-1 上游引物：5′-TGCAGATGCTTATGACAGCGA-3′ 137
下游引物：5′-CTATCTGACCAGCTTCGCCC-3′
中性甲醛中固定以备病理形态观察，另一部分心肌组织
GSDMD 上游引物：5′-AAGTGCTGCGCAGTATTAGCA-3′ 107
放入－80 ℃冰箱保存以备Western blot及PCR检测。 下游引物：5′-TCTGGACCCACAAAGCCAAT-3′
2.3 一般情况观察 NF-κB 上游引物：5′-CTCAGGACGAATAGCCTCGG-3′ 97
下游引物：5′-AGTAGGTGTGCCACCCTCG-3′
实验期间，观察金黄地鼠的饮食、饮水、尿量、毛发 IL-1β 上游引物：5′-GCAGGCTCCGAGATGAACAA-3′ 79
等变化，记录金黄地鼠死亡情况。 下游引物：5′-TGTCCGTTGAGATGGAGAGC-3′
2.4 血糖、血脂及心肌酶检测 2.9 心 肌 组 织 NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κ B、
取“2.2”项下金黄地鼠尾部血0.1 mL，使用血糖仪检 IL-1β蛋白阳性表达观察
测血糖。取“2.2”项下血清 20 μL，严格按照试剂盒说明 采用 SABC 法，使用兔 SP 试剂盒检测。取“2.6”项
书要求检测血脂TC水平和心肌酶CK-MB水平。 下石蜡包埋的心肌组织，切成5 μm的薄片，置于载玻片
2.5 左室射血分数、短轴缩短率检测 上，烤片 2 h，依次加入二甲苯 30 min、无水乙醇 10 min、
金黄地鼠吸入异氟烷麻醉后，应用超声仪获取左室 95％乙醇 5 min、80％乙醇 5 min 进行脱蜡复水，将石蜡
长轴二维超声图像，计算左室射血分数（ejection frac- 切片与 NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κB、IL-1β一抗
tion，EF）和短轴缩短率（fractional shortening，FS）。EF （稀释度均为1∶100）于4 ℃孵育12 h，使用羊抗兔IgG聚
（％）＝心脏每搏输出量/舒张末期心室容积×100％，FS 合物于 37 ℃孵育 1 h，DAB 显色，苏木精染色，封片，于
（％）＝（左心室舒张末期内径－左心室收缩末期内径）/ 显微镜下观察并拍照。细胞呈现淡黄或黄褐色颗粒表
左心室舒张末期内径×100％。 示目的蛋白呈阳性表达。
2.6 心肌组织病理形态观察 2.10 心肌组织GSDMD蛋白表达水平检测
取“2.2”项下中性甲醛中的心肌组织进行常规脱水、 采用Western blot法检测。称取“2.2”项下心肌组织
固定、石蜡包埋、切片，分别采用苏木精-伊红（HE）染色、 50 mg，提取总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
Masson染色，于显微镜下观察心肌组织的病理形态变化 胶电泳，随后将印记转至PVDF膜上，使用快速封闭液封
并拍照。 闭后，将膜与 GSDMD、内参β-actin 一抗（稀释度分别为
2.7 血清炎症因子检测 1 ∶ 500、1 ∶ 1 000）于 4 ℃孵育 12 h，然后与羊抗兔 IgG 二
采用酶联免疫吸附试验检测。取“2.2”项下血清20 抗（稀释度为1 ∶ 5 000）于37 ℃孵育1 h，显影，拍照。采
μL，严格按照试剂盒说明书要求检测 IL-1β、TGF-β1 用 Image J 软件计算，以目标蛋白灰度值与内参蛋白灰
水平。 度值比值表示目标蛋白的表达水平。

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