Page 83 - 《中国药房》2022年11期
P. 83

清洗细胞 3 次。将细胞分为空白对照组（0 μmol/L）和                     的细胞密度接种于直径为60 mm的细胞培养皿中，待细
        EP-3P不同浓度组（5、10、20 μmol/L，浓度根据“2.2”项下              胞培养至贴壁后，将细胞分为空白对照组（0 μmol/L）和
        MTT实验结果和本课题组前期预实验结果设置，下同），                         EP-3P 不同浓度组（5、10、20 μmol/L）。药物作用 24 h
        每组设置3个复孔。分别在培养0、24 h后，用倒置显微                        后，每个培养皿加入 PMSF 和 RIPA 裂解液的混合液
        镜观察划痕愈合情况，并拍照。利用 Image J V1.8.0 软                  （PMSF 和 RIPA 裂解液的体积比为 1 ∶ 100）500 μL，于冰
        件测定划痕面积，计算细胞的迁移愈合率：迁移愈合率                           上裂解细胞 30 min，提取细胞中总蛋白，采用 BCA 法进
       （％）＝（0 h 时划痕面积－24 h 时划痕面积）/0 h 时划痕                  行蛋白定量，并将蛋白高温变性。取变性后的蛋白样品
        面积×100％。实验重复3次。                                    30 μg，在80 V电压下进行10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯
        2.4 EP-3P对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响                      酰胺凝胶电泳分离，在 300 mA 恒流下将蛋白转移至聚
            采用 Transwell 小室法进行检测。将 Matrigel 基质             偏二氟乙烯膜上，用 5％的脱脂奶粉在室温下封闭 2 h；
        胶与无血清培养基按照体积比 1 ∶ 8 混匀后，按 50 μL/孔                  加入内参蛋白 GAPDH 一抗（稀释比例 1 ∶ 5 000）和目标
        的量加入到 Transwell 小室上层。将细胞侵袭小室置于                     蛋 白 Bcl-2、Bax、Cyt-C、caspase-3、cleaved-caspase-3、
        培养箱中，将Matrigel烘干，然后弃掉多余的培养基。取                      MMP-2、MMP-9一抗（稀释比例均为1 ∶ 1 000），4 ℃孵育
                                                 5
        对数生长期的 MDA-MB-231 细胞，制成 1.5×10 个/mL                过夜；以 TBST 缓冲液漂洗 10 min×3 次，加入相应二抗
        的细胞悬液，分别给予0（空白对照组）、5、10、20 μmol/L                  （稀释比例均为1 ∶ 3 000），室温孵育2 h；以TBST缓冲液
        的EP-3P（EP-3P不同浓度组）刺激，每个浓度组设置3个                     漂洗 10 min×3 次，加 ECL发光液，然后于凝胶成像仪中
        平行组。然后分别取上述给药后的细胞悬液 100 μL 加                       成像。用 Image J V1.8.0 软件对蛋白条带进行分析，以
        入到 Transwell 小室上层，下层中加入含 10％胎牛血清                   目标蛋白条带灰度值与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值
        的培养基 700 μL。将细胞侵袭小室置于培养箱中培养                        的比值表示目标蛋白的表达水平。实验重复3次。
        24 h，然后以 4％多聚甲醛固定 30 min，再用 1％结晶紫                  2.8  统计学方法
        染色30 min后，于倒置显微镜下观察穿过基底膜的侵袭                            采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资
        细胞。每个样本计数 5 个视野，取平均值作为检测结                          料采用 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组
        果。实验重复3次。                                          间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
        2.5  EP-3P对MDA-MB-231细胞凋亡的影响                       3 结果
            采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色法进行检测。取对                 3.1  EP-3P对MDA-MB-231细胞增殖的影响结果
        数生长期的 MDA-MB-231 细胞，常规制备细胞悬液后，                         与 空 白 对 照 组 比 较 ，不 同 浓 度 EP-3P 作 用 于
        将细胞以 1×10 个/孔的密度接种于 6 孔板中，培养 24 h                  MDA-MB-231细胞24、48、72 h后，细胞的增殖抑制率均
                     5
        后，按照“2.3”项下方法分组与给药。继续培养 24 h 后，                    不同程度地升高，并呈一定的浓度和时间依赖趋势。其
        收集、洗涤细胞，先后加入Annexin Ⅴ-FITC、PI试剂各5                  中，除EP-3P 1.25 μmol/L组细胞在培养24 h时的增殖抑
        μL，混匀，于室温下避光反应15 min后，采用流式细胞仪                      制率外，其余各浓度EP-3P组细胞在药物作用24、48、72 h
        检测细胞凋亡情况，并通过 Flow jo 10 软件分析各组细                    后的增殖抑制率均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。各
        胞的凋亡率。实验重复3次。                                      组细胞的增殖抑制率测定结果见表1。
        2.6  EP-3P对MDA-MB-231细胞周期分布的影响                      表1   各组细胞的增殖抑制率测定结果（x±±s，n＝3，％％）
            采用流式细胞术进行检测。取对数生长期的MDA-                         组别               24 h       48 h        72 h
        MB-231细胞，按照“2.5”项下方法接种、分组、给药、培养                     空白对照组             0          0           0
                                                            EP-3P 1.25 μmol/L组  5.91±4.55  6.53±4.02 a  10.60±3.62 b
                                  6
        并收集。制备细胞密度为1×10 个/mL的单细胞悬液，离                        EP-3P 2.5 μmol/L组  11.13±4.85 a  14.95±4.15 b  22.98±2.13 b
        心（2 000 r/min，5 min）去除上清，加入70％冷乙醇500 μL，            EP-3P 5 μmol/L组  36.94±7.86 b  40.39±4.76 b  48.42±4.51 b
                                                            EP-3P 10 μmol/L组  58.59±6.74 b  60.75±6.29 b  72.42±1.72 b
        4 ℃固定过夜；用预冷的PBS洗细胞3遍，除去残留的乙
                                                            EP-3P 20 μmol/L组  70.88±3.86 b  79.47±4.39 b  84.53±1.80 b
        醇；加入 500 μL 提前配制好的 PI/RNase A 染色液（临用                EP-3P 40 μmol/L组  86.82±5.74 b  92.15±4.06 b  95.32±1.61 b
        前 PI 与 RNase A 染色液按 9 ∶ 1 的体积比配制），37 ℃避                a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与空白对照组比较，P＜0.01
        光孵育 30 min 进行染色，采用流式细胞仪检测，并通过                      3.2 EP-3P对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影
        Flow jo 10软件分析细胞周期分布。实验重复3次。                       响结果
        2.7  EP-3P对MDA-MB-231细胞中凋亡和侵袭相关蛋                       与空白对照组比较，EP-3P 10、20 μmol/L 组细胞的
        白表达的影响                                             迁移愈合率显著降低（P＜0.01），EP-3P 5、10、20 μmol/L
            采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的                  组穿过基底膜的侵袭细胞数显著减少（P＜0.01），且均
        MDA-MB-231 细胞，制成单细胞悬液后，以 8×10 个/皿                  呈一定的浓度依赖趋势。结果见图2、图3和表2。
                                                  5

        中国药房    2022年第33卷第11期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 11  ·1357 ·
   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88