Page 82 - 《中国药房》2022年11期
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死亡 。因此，探寻治疗乳腺癌的有效药物仍然是亟待                            细胞毒性检测试剂盒（批号C0038）、二喹啉甲酸（BCA）
             [2]
        解决的问题。                                              蛋白浓度试剂盒（批号 P0010）、RIPA 裂解液（上海碧云
            从天然产物中寻找抗肿瘤药物或抗肿瘤辅助药物，                          天生物技术有限公司），Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检
        并对其结构进行改造或修饰，已成为国内外研究的重点                            测试剂盒（美国 Invitrogen 公司，批号 1753025），细胞周
        内容之一。过氧化麦角甾醇（ergosterol peroxide，EP）是               期检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批
        一种过氧化甾体类天然产物，广泛存在于多种真菌中                     [3－4] 。  号 KGA512），Matrigel 基 质 胶（美 国 BD 公 司 ，批 号
        已有大量文献报道，EP可通过细胞毒性作用抑制癌细胞                           356234），鼠 源 B 淋 巴 细 胞 瘤 2（B-cell lymphoma-2，
        生长  [5－7] 。研究发现，EP 作为一种重要的活性先导化合                    Bcl-2）和兔源 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X pro-
        物，其特有的5α，8α-过氧桥是关键药效载体                [8－10] 。EP的   tein，Bax）、细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）、胱天蛋白
                                                     [11]
        C-3 位和 C-17 位具有较大的结构修饰空间，如 Li 等 、                   酶 3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3）、
              [12]
        Han 等 分别在 EP 的 C-17 位引入吲哚醌取代基和酰肼                    活化的 caspase-3（cleaved-caspase-3）、基质金属蛋白酶 2
        侧链合成了新的化合物，并发现上述合成的化合物均可                           （matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、甘油醛-3-
        显著抑制癌细胞的增殖、诱导癌细胞凋亡；再如Bu等                      [13]  磷酸脱氢酶（GAPDH）8 种单克隆抗体以及辣根过氧化
        发现，在EP的C-3位引入氨基甲酸酯极性基团对提升其                          物酶标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠免疫球蛋白 G（IgG）
        抑制肿瘤细胞增殖的活性至关重要。                                    二抗（美国Cell Signaling Technology公司），ECL发光试
            紫杉醇是一种公认的治疗乳腺癌的药物，其结构中                          剂盒（北京康为世纪生物科技股份有限公司，批号
                                          [14]
        的 C-13 侧链与其抗肿瘤作用密切相关 。为进一步推                         CW0049），其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
        进 EP 结构衍生化研究，筛选具有更强抗肿瘤活性的新                          1.3 细胞
        化合物，本课题组前期以EP作为先导化合物，通过在其                               人三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 购自中国科学
        C-3 位羟基引入紫杉醇的侧链（4S，5R）-3-叔丁氧羰                       院上海细胞库。
        基-2，2-二甲基-4-苯基-1，3-       唑烷-5-甲酸，合成了全新             2 方法
        的EP衍生物EP-3P（结构见图1）。本研究拟通过体外实                        2.1  细胞培养
        验初步考察 EP-3P 对人三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-                          将 MDA-MB-231 细胞培养于含 10％胎牛血清、1％
        231 增殖、迁移和侵袭的影响，并探讨其可能的作用机                          双抗（100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）的 L-15 培
        制，以期为乳腺癌治疗相关药物的开发研究提供参考。                            养基中，置于 37 ℃、无 CO2的培养箱中培养。本研究选
                                                            用传代6～10代的细胞进行实验。
                                                            2.2  EP-3P对MDA-MB-231细胞增殖的影响
                                                                采用 MTT 法进行检测。取对数生长期的 MDA-
                                                            MB-231细胞，胰酶消化后用L-15完全培养基稀释成2×
                                                            10 个/mL 的细胞悬液，将细胞悬液按 100 μL/孔接种于
                                                              4
                                                            96孔板中。实验设置空白对照组（不加任何药物处理培
                                     EP
                                                            养的细胞，即0 μmol/L）、EP-3P不同浓度组（1.25、2.5、5、
                         化学分子式：C42H61NO7
                                                            10、20、40 μmol/L，药物浓度根据前期预实验结果设置），
                      图1   EP-3P的化学结构
                                                            每组平行设置3个复孔；并设置空白调零孔（不加细胞，
        1 材料                                                只加培养液）。分别在培养24、48、72 h时，每孔加入0.5
        1.1 主要仪器                                            mg/mL 的 MTT 溶液 10 μL，培养箱中常规培养 4 h 后弃
            本研究所用的主要仪器包括：Axio observer A1型倒                 去 MTT，再每孔加入 150 μL DMSO 振荡 30 min 溶解甲
        置显微镜（德国 Zeiss 公司），SAFIRE2 型多功能酶标仪                   瓒结晶；然后采用多功能酶标仪测定各孔在490 nm波长
        （瑞士 Tecan 公司），Power/PAC3000 型电泳仪、Chemi-             处的光密度值，并计算细胞的增殖抑制率：增殖抑制率
        Doc MP 型凝胶成像仪、FACS Calibur 型流式细胞仪（美                （％）＝[1－（给药组光密度值－空白调零孔光密度值）/
        国Bio-Rad公司）。                                       （空白对照组光密度值－空白调零孔光密度值）]×
        1.2 主要药品与试剂                                         100％。实验重复3次。
            本研究所用的主要药品与试剂包括：EP-3P（由齐齐                       2.3 EP-3P对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响
        哈尔医学院药物化学研究室提供，批号 20211020，经高                           采 用 细 胞 划 痕 法 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期 的
        效液相色谱法和核磁共振法检测其纯度均在 98％以                            MDA-MB-231 细胞，以 1×10 个/孔的细胞密度接种于 6
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        上），L-15培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司），重组胰                    孔板中，常规培养过夜，然后采用无菌枪头在垂直于板
        蛋白酶消化液、二甲基亚砜（DMSO）、MTT 细胞增殖与                        的横轴方向划出等宽的直线划痕，用磷酸盐缓冲液（PBS）


        ·1356 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 11                                 中国药房    2022年第33卷第11期
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