Page 42 - 《中国药房》2022年8期
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批准后实施（受理编号gdpulac2020143）。                          行 PCR 扩增。PCR 反应体系（共 10 μL）包括：cDNA 模
        2 方法                                                板0.5 μL，TB Greenpremix Ex Taq Ⅱ 5 μL，上、下游引物
        2.1 Que-HSA-NPs的制备                                  各0.4 μL，DEPC水3.7 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变
            采用去溶剂化-化学交联法制备。将 Que 原料药溶                       性30 s；95 ℃变性5 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40
        解在DMSO中，得质量浓度为20 mg/mL的Que溶液；将                      个循环。采用2      －ΔΔCt 法计算各目标mRNA的相对表达量。
        HSA 溶解在 PBS 中，涡旋使充分溶解，得质量浓度为 5                      2.4 体内实验
        mg/mL的HSA溶液。取HSA溶液2 mL于烧杯中，将烧                       2.4.1  造模与给药      将32只C57BL/6J小鼠分为空白对
        杯置于磁力搅拌器上，取 Que 溶液 50 μL 以 1 mL/min 的               照组、模型组、Que给药组、Que-HSA-NPs给药组，每组8
        滴速滴入 HSA 溶液中，得黄色胶状混合物；通过自动注                         只。除空白对照组外，模型组、Que 给药组和 Que-HSA-
        射泵以 1 mL/min 的速度将乙醇[用以去溶剂化，即通过                      NPs 给药组给予低蛋氨酸和胆碱缺乏高脂鼠粮 12 周以
        脱水剂（乙醇）除去 HSA 的水化膜，使 HSA 的疏水区域                      复制NASH肝纤维化模型。喂养6周后，空白对照组、模
        暴露]2 mL 滴入上述黄色胶状混合物中，然后在室温下                         型组小鼠尾静脉注射 PBS，Que 给药组和 Que-HSA-NPs
        避光搅拌 3 h；搅拌充分后，加入 EDC 进行化学交联，反                      给药组小鼠尾静脉注射Que原料药或Que-HSA-NPs（以
                                                                                              [9]
        应 12 h 后将黄色胶状混合物以 10 000 r/min 离心 15                PBS 为溶剂，注射前振摇混匀）25 mg/kg ，每周 3 次，共
        min×3 次以除去未结合的 Que 和 DMSO；将离心纯化所                    6周。
        得沉淀物重新分散到 PBS 中，即得 Que-HSA-NPs 混悬                   2.4.2  标本采集与处理         给药结束后，腹腔注射 3％戊
        液，于4 ℃下储存，备用。                                       巴比妥溶液麻醉，剖开腹腔，于腹主动脉采血（无需置于
        2.2 Que-HSA-NPs的表征                                  抗凝管中），血样静置 2 h 后以 4 500 r/min 离心 12 min，
            取上述Que-HSA-NPs混悬液，使用激光粒度仪测定                     收集上层血清并于－80 ℃下保存。取肝组织适量，置于
        粒径大小和分布、Zeta 电位，使用透射电镜观察形态特                         4％中性福尔马林溶液中固定24 h以进行组织病理学检
        征（3％磷钨酸染色，pH7.0），使用紫外-可见分光光度计                       测，其余肝组织于－80 ℃下保存，备用。
                  [8]
        测定载药量 。                                             2.4.3  肝损伤指标检测         将血清样本解冻，振荡混匀；
        2.3  体外实验                                           严格按照 ALT、AST 试剂盒说明书步骤，使用酶标仪检
        2.3.1  细胞活性的检测         采用 CCK-8 法进行检测。将             测各组小鼠血清中ALT、AST的水平。
        HSC-T6细胞以1×10 个/mL接种于96孔板，每孔100 μL。                 2.4.4  小鼠肝组织病理学观察            组织切片分别经苏木
                          5
        待细胞贴壁并增殖到 70％左右时，分别加入含 0（对照                         精-伊红（hematoxylin and eosin staining，HE）和 Masson
        组）、1、5、25、125、250、500 μg/mL（浓度参考预实验结果               染色后，于显微镜下观察各组小鼠肝组织的染色情况。
        设置）Que 原料药或 Que-HSA-NPs（以 Que 计）的完全培                在高倍视野下随机选取小鼠肝组织Masson染色图5张，
        养基（即含 10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗的                          使用Image J 8.0软件测量每个视野下的纤维化程度。
        DMEM高糖培养基，下同），于37 ℃、5％CO2下培养（培                      2.4.5  小鼠肝组织中 TGF-β、COL1A1 和α-SMA mRNA
        养条件下同），同时设置不含细胞和药物的空白孔。12 h                         表达情况检测         采用 real-time PCR 法进行检测。取小
        后，吸弃培养基，加入含10％CCK-8试剂的完全培养基，                        鼠肝组织约 10 mg，置于 1.5 mL EP 管中，加入 TRIZOL
        孵育2 h后，使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光                        试剂和氯仿、异丙醇等试剂提取细胞的总 RNA，后续按
        密度（optical density，OD），并根据下式计算细胞存活率：               “2.3.2”项下方法操作，测定各组小鼠肝组织中 TGF-β、
        细胞存活率＝[（OD 实验孔－OD 空白孔 ）/（OD 对照孔－OD 空白孔 ）]×          COL1A1和α-SMA mRNA的相对表达量。
        100％。每个浓度设置6个复孔，实验重复3次。                             2.4.6  小鼠肝组织中α-SMA 蛋白表达量的检测                 采用
        2.3.2  细胞中 TGF-β、COL1A1 和α-SMA mRNA 表达情             Western blot 法进行检测。取小鼠肝组织约 10 mg，加入
        况的检测       采用real-time PCR法进行检测。将HSC-T6             含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液提取肝组织的总蛋白，
                   5
        细胞以 1×10 个/mL 接种于 6 孔板，每孔 2 mL。将细胞                  测定浓度后将蛋白变性。变性蛋白经8％十二烷基硫酸
        分为对照组、Que 给药组和 Que-HSA-NPs 给药组，每组                   钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶电压80 V，分离胶电压
        设置 3 个复孔。培养 24 h 后，分别加入含 0（对照组）、                    120 V，电泳时间约2 h）分离后，以湿转法（恒定电流200
        50、100、200 μg/mL（浓度参考上述 CCK-8 实验结果设                 mA，约 120 min）转移至 PVDF 膜上，用 5％脱脂奶粉封
        置）Que 原料药或 Que-HSA-NPs（以 Que 计）的完全培养                闭1.5 h，加入目标蛋白α-SMA、内参HSP90一抗（稀释比
        基，继续培养。24 h 后，收集细胞，加入 TRIZOL 试剂和                    例分别为1 ∶ 200、1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育过夜；用TBST缓
        氯仿、异丙醇等试剂提取细胞的总 RNA 并用无酶水复                          冲液清洗3次后，加入HRP标记的IgG二抗（稀释比例为
        溶；取上述复溶溶液1 μL于微量分光光度计和荧光分光                          1∶2 000）孵育1 h，加入ECL试剂显影并于凝胶自动成像
        光度计上测定 RNA 含量并验证其纯度后，按试剂盒说                          仪上成像。使用Image J 8.0软件分析各条带灰度值，以
        明书操作将RNA反转录成cDNA，并以cDNA为模板进                         目标蛋白与内参蛋白灰度值的比值作为其表达量。


        ·932 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 8                                    中国药房    2022年第33卷第8期
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