Page 41 - 《中国药房》2022年8期
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非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver di-        分别为 Q4951、A0307A、SLBV2994、SLBV6928）均购自
        sease，NAFLD）是一系列与肥胖、2型糖尿病及代谢综合                     美 国 Sigma 公 司 ；二 甲 基 亚 砜（dimethyl sulfoxide，
        征密切相关的肝脏疾病，被定义为在几乎没有酒精摄                            DMSO，批号 Y190601）购自广州瑞舒生物科技有限公
        入、病毒感染或其他特定因素的状态下，超过5％的肝细                          司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐[1-
        胞存在脂肪变性的疾病 。NAFLD 已成为全球范围内                         （3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochlo-
                             [1]
        常见的慢性肝脏疾病之一，其在全球范围内的患病率约                           ride，EDC，批号C10081863]购自上海麦克林生化科技有
              [2]
        为25％ 。NAFLD疾病谱包括非酒精性脂肪肝、非酒精                        限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、
        性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、非       DMEM 高糖培养基、胎牛血清（批号分别为 8121318、
        酒精性脂肪性肝纤维化和肝硬化。其中，NASH是一种                          8121334、2275124）均购自美国Gibco公司；青霉素-链霉
        潜在的进行性肝脏疾病，可导致肝硬化、肝细胞癌和死                           素双抗（批号 30002351）购自美国 Corning 公司；胰酶细
          [3]
        亡 ，NASH及其相关肝纤维化是诱发NAFLD患者死亡                        胞 消 化 液（批 号 21105381）购 自 北 京 Biosharp 公 司 ；
                  [4]
        的主要原因 。肝纤维化是肝细胞外基质异常沉积的病                           CCK-8 试剂盒购于日本 Dojindo 公司；TRIZOL 试剂（批
        理过程，逆转肝纤维化可有助于防止患者病情向肝硬                            号 290307）购 自 美 国 Invitrogen 公 司 ；无 酶 水（批 号
        化、肝癌恶化 。但迄今为止，尚无有效治疗NASH肝纤                         GB19KA7899）购自生工生物工程（上海）股份有限公
                   [4]
        维化的临床药物。                                           司；Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒（批号 A3A1201）
            槲皮素（quercetin，Que）具备清除自由基、保护肝损
                                                           购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；天冬氨酸转氨酶
        伤、抗肝纤维化等药理作用，是治疗肝脏疾病的有效活
                                                           （aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸转氨酶（ala-
                  [5]
        性成分之一 。作为黄酮类化合物的一种，Que 的水溶
                                                           nine aminotransferase，ALT）活性试剂盒和 Masson 试剂
        性差（约1 mg/L），口服吸收不佳，化学稳定性差，极大地
                                                           盒（批号分别为 20210305、20210120、20210317）均购自
                              [6]
        影响了药物的生物利用度 。由肝脏产生的人血清白蛋
                                                           南京建成生物工程研究所有限公司；蛋白酶抑制剂（批
        白（human serum albumin，HSA）作为药物载体时，具备
                                                           号 45582400）购自瑞士 Roche 公司；RIPA 裂解液（批号
        生物相容性良好、安全、无毒、可降解、靶向性佳等优
                                                           12G235174）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；兔
        势 。基于此，本研究拟制备槲皮素-白蛋白纳米粒
          [7]
                                                           源α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单
       （quercetin-HSA-nanoparticles，Que-HSA-NPs），并 评 价
                                                           克隆抗体（批号ab5694）购自英国Abcam公司；兔源热休
        Que-HSA-NPs 对 NASH 肝纤维化的作用，为 Que-HSA-
                                                           克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）单克隆抗体、辣
        NPs 的深入研究和应用提供理论依据，也为抗 NASH 肝
                                                           根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊
        纤维化纳米制剂的研发提供方向。
                                                           抗兔免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）二抗（批号
        1 材料
                                                           分别为 4877、7074s）均购自美国 CST 公司；增强型化学
        1.1  主要仪器                                          发 光（enhanced chemiluminescence，ECL）试 剂（批 号
            本研究所用主要仪器包括 ZETASIZER NANO ZS
                                                           170-5061）购自美国Bio-Rad公司；转化生长因子β（trans-
        型激光粒度仪（英国 Malvern 公司），UV1300/1500 型紫
                                                           forming growth factor-β，TGF-β）、Ⅰ型胶原α1（collagen
        外-可见分光光度计[美析（中国）仪器有限公司]，H-7650
                                                           type Ⅰ α1，COL1A1）的引物序列由生工生物工程（上
        型透射电镜[日立高新技术（上海）国际贸易有限公司]，
                                                           海）股份有限公司设计合成（见表1）；其余试剂均为分析
        CLM-170B-8-NF 型二氧化碳（CO2 ）细胞培养箱（新加坡
                                                           纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。
        Esco 公司），BHC-1000ⅡA/B3 型超净工作台（苏净集团
                                                                          表1    PCR引物序列
        苏州安泰空气技术有限公司），DMI8 型倒置显微镜、
                                                            基因         上游（5′→3′）             下游（5′→3′）
        BX51型显微镜（德国Leica公司），5810R型离心机（德国
                                                            TGF-β  CTCCCGTGGCTTCTAGTGC  GCCTTAGTTTGGACAGGATCT
        Eppendorf 公司），ND ONE 型微量分光光度计和荧光分                   COL1A1  GCTCCTCTTAGGGGCCACT  CCACGTCTCACCATTGGGG
        光光度计、5100 型实时聚合酶链反应（real-time poly-                 α-SMA  GTCCCAGACATCAGGGAGTAA  TCGGATACTTCAGCGTCAGGA
        merase chain reaction，real-time PCR）仪（美 国 Thermo    β-actin  CGTGTACGTTGCTATCCAGGC  CTCCTTAATGTCACGCACGAT
        Fisher Scientific 公 司），EON 型 多 功 能 酶 标 仪（美 国       1.3 细胞、动物及饲料
        BioTek 公司），ZT-12M 型脱水机、YB-6LF 型石蜡包埋                    本研究所用的鼠源HSC-T6细胞由广东药科大学叶
        机、3126F型石蜡切片机、YT7FB型烘片机（亚光医用电                      得伟教授课题组赠予；8 周龄 SPF 级 C57BL/6J 雄性小
        子科技公司），JXFSTPRP-24型匀浆机（上海净信实业发                     鼠[生产许可证号SCXK（豫）2020-0005]由河南斯克贝斯
        展有限公司），MINICHEMI 型凝胶自动成像仪（北京赛                      生物科技股份有限公司提供并饲养于广东药科大学实
        智创业科技有限公司）等。                                       验动物中心；低蛋氨酸和胆碱缺乏高脂鼠粮（批号为
        1.2  主要药品与试剂                                       CDAHF60）购于戴茨生物科技（无锡）有限公司。本动
            Que原料药（纯度≥95％）、HSA、伊红、苏木精（批号                   物实验方案经广东药科大学实验动物伦理委员会审查


        中国药房    2022年第33卷第8期                                               China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 8  ·931 ·
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