Page 31 - 《中国药房》2022年5期
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参考前期预实验结果设置），每组设置3个复孔。加入相 物科技有限公司设计并合成，引物序列及扩增产物大小
应培养液常规培养48 h后，于倒置显微镜下观察细胞形 见表1。
态并收集图像。 表1 PCR引物序列及扩增产物大小
2.3 HEK293细胞中SBE的转录活性测定 基因名称 引物序列 扩增产物大小，bp
采用荧光素酶报告基因法进行测定。取对数生长 α-SMA 上游：5′-GGCATTCACGAGACCACCTAC-3′ 84
下游：5′-CGACATGACGTTGTTGGCATAC-3′
期的 HEK293 细胞，按 4×10 个/孔接种于 96 孔板中，待 COL-Ⅰ 上游：5′-GTGCGATGACGTGATCTGTGA-3′ 119
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TM
细胞融合度超过 80％时，将 SBE 质粒用 PolyJet DNA 下游：5′-CGGTGGTTTCTTGGTCGGT-3′
FN 上游：5′-ACGGTTTCCCATTACGCCAT-3′ 193
体外转染试剂瞬时转染到细胞中，6 h 后更换 DMEM 高
下游：5′-TCATCCGCTGGCCATTTTCT-3′
糖培养基正常培养。将细胞分为对照组（含1‰二甲基亚 β-actin 上游：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′ 250
砜的 DME/F-12 培养基）、TGF-β 1组（10 ng/mL TGF-β 1 ）、 下游：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′
SIS3 组（10 nmol/L 阳性对照药 SIS3+10 ng/mL TGF-β 1 ） 2.6 HK-2细胞中α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、Smad3、
和不同浓度 G-Rb1 组（1.0、2.5、5.0、10、20、30 μmol/L COL-ⅠⅠ、FN蛋白表达测定
G-Rb1+10 ng/mL TGF-β 1 ），每组设置6个复孔；并另设空 2.6.1 Western blot 法测定 HK-2 细胞中α-SMA、E-cad-
白对照组（该组无细胞只有DMEM高糖培养基）。加入 herin、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN 蛋白表达 取对数
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相应的培养液处理细胞24 h后，按照荧光素酶报告基因 生长期的 HK-2 细胞，按 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，常
试剂盒方法进行操作，采用酶标仪测定各孔的荧光强度 规培养24 h后，按“2.2”项下方法分组、造模、给药、培养，
值，并计算相对荧光素酶活力：相对荧光素酶活力＝（实 每组设置 3 个复孔。将处理后的 HK-2 细胞用 PBS 清
验组荧光强度值－空白对照组荧光强度值）/（对照组荧 洗 3 遍，收集细胞，根据 RIPA 试剂盒说明书方法提取细
光强度值－空白对照组荧光强度值）。相对荧光素酶活 胞中总蛋白，采用 BCA 法进行蛋白定量。将蛋白高温
力越高，表示SBE的转录活性越强。实验重复3次。 变性后，进行 SDS 凝胶电泳（55 V，30 min；120 V，60
2.4 HK-2细胞的相对活力测定 min）分离，然后电转至 PVDF 膜（电流 350 mA），5％脱
采用 MTT 法进行测定。取对数生长期的 HK-2 细 脂奶粉封闭2 h；加入一抗（β-actin、α-SMA、FN、p-Smad3
胞，按1×10 个/孔接种于96孔板中，常规培养24 h后，按 一抗的稀释比例均为1∶1 000，Smad3一抗的稀释比例为
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“2.3”项下方法分组（不设阳性对照药组；给药组扩大浓 1 ∶ 3 000，COL-Ⅰ一抗的稀释比例为1 ∶ 5 000，E-cadherin
度范围，加设1个 40 μmol/L G-Rb1组）及造模、给药、培 一抗的稀释比例为 1∶10 000），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜
养，每组设置6个复孔。加入相应培养液培养24 h后，每 10 min×3 次，加入相应二抗（稀释比例均为 1 ∶ 10 000），
孔避光加入终质量浓度为 5 mg/mL的 MTT 试剂 20 μL， 室温孵育 2 h；TBST 洗膜 10 min×4 次，在自动凝胶成像
继续培养 4 h；弃去培养基，每孔加入二甲基亚砜 150 仪上显影。使用Image J V1.8.0软件测定各条带的灰度
μL，振摇 10 min。使用酶标仪于 490 nm 波长处测定各 值，以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值
孔光密度（OD）值，并计算细胞的相对活力：细胞相对活 表示目标蛋白的表达水平。实验重复3次。
力（％）＝[（实验组OD值－空白对照组OD值）/（对照组 2.6.2 免 疫 荧 光 法 测 定 HK-2 细 胞 中 α-SMA、E-cad-
OD值－空白对照组OD值）]×100％。实验重复3次。 herin、FN 蛋白表达 取对数生长期的 HK-2 细胞，按 2×
2.5 HK-2 细 胞 中 α-SMA、COL- ⅠⅠ 、FN mRNA 表 达 10 个/孔接种于6孔板中，常规培养24 h后，按“2.2”项下
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测定 方法分组、造模、给药、培养，每组设置3个复孔。将处理
采用RT-qPCR法进行测定。取对数生长期的HK-2 后的HK-2细胞用PBS清洗3遍，于冰上使用4％多聚甲
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细胞，按 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，常规培养 24 h 后， 醛固定 1 h，PBS 洗去残留的多聚甲醛；在室温下使用
按“2.2”项下方法分组、造模、给药、培养，每组设置 3 个 0.3％ TritonX-100 透化 30 min，使用山羊血清封闭 2 h，
复孔。采用 Trizol 法抽提细胞中总 RNA，验证总 RNA 加入α-SMA、FN、E-cadherin一抗（稀释比例均为1∶250），
纯度后，按 BeyoR TM Ⅲ cDNA 试剂盒方法将 RNA 逆转 4 ℃孵育过夜；除去一抗，PBS摇洗5 min×3次，加入相应
录 成 cDNA，再 按 照 Power Up TM SYBRTM Green PCR 二抗（稀释比例均为 1 ∶ 300），避光孵育 1 h；除去二抗，
Master Mix试剂盒方法进行RT-qPCR分析。反应条件： PBS 摇洗 5 min×3 次，避光加入 DAPI 复染 30 min；PBS
50 ℃加热 2 min，95 ℃预变性 2 min；95 ℃ 变性 15 s， 摇洗后，加入荧光抗猝灭剂。在暗室中使用荧光倒置显
60 ℃ 退火 1 min，72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以 微镜采集图像，并使用Image Pro Plus 6.0软件测定蛋白
β-actin为内参基因，采用2 －ΔΔCt 法分析各目标基因mRNA 的荧光强度值，该值越大，表示目标蛋白阳性表达越
的相对表达量。实验重复3次。引物序列由武汉淼灵生 强。实验重复3次。
中国药房 2022年第33卷第5期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 5 ·537 ·
