Page 30 - 《中国药房》2022年5期
P. 30

KEYWORDS     ginsenoside Rb1；TGF-β 1/Smad3 signaling pathway；transforming growth factor β 1；renal tubular epithelial cells；
        epithelial-mesenchymal transition


            糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）是           号 10013CVR），胎牛血清（美国 Gibco 公司），报告基因
        糖尿病患者严重的并发症之一，且30％～47％的糖尿病                          载体SBE（Smad binding element）质粒（武汉淼灵生物科
        患者都伴随有 DKD，而 DKD 是终末期肾病的主要原                         技有限公司，批号 P0756），Luciferase Assay Sysem Free-
        因  [1 － 4] 。 上 皮 细 胞 - 间 质 转 化（epithelial-mesenchymal  zew Pack 荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国 Promega
                                                      [5]
                                                                                       TM
        transition，EMT）是 DKD 发生的主要病理特征之一 。                  公司，批号 0000440829），BeyoR Ⅲ cDNA 第一链合成
        肾小管上皮细胞发生 EMT 后，会影响肾小管重吸收功                          试 剂 盒（上 海 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司 ，批 号
        能，并引发肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF），       103118190503），Power Up TM  SYBRTM Green PCR Mas-
        导致肾功能下降 。因此，抑制肾小管上皮细胞发生EMT                          ter Mix（美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司 ，批 号
                      [6]
        可延缓 DKD 的进程       [7－8] 。研究表明，转化生长因子β 1/            00837276），MTT 检 测 试 剂 盒 、RIPA 试 剂 盒 、Tri-
        Smad 家族成员 3（transforming growth factor-β 1/mothers  tonX-100、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技
        against decapentaplegic homolog 3，TGF-β 1/Smad3）通路  有 限 公 司 ，批 号 分 别 为 725C056、R0010、T8200、
        的激活与DKD的发展及肾小管上皮细胞发生EMT密切                           PC0020），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫
            [9]
        相关 。TGF-β 1能有效诱导肾小管上皮细胞发生EMT，                       球蛋白G（IgG）二抗（武汉博士德生物工程有限公司，批
        促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）如胶原蛋               号 BST14B25C15K27），兔 源 α- 平 滑 肌 肌 动 蛋 白
        白、纤连蛋白（fibronectin，FN）的表达       [10－11] 。现代研究发     （α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗体（武汉塞维
        现，人参能够抗糖尿病，调节 EMT             [12－13] 。人参皂苷 Rb1     尔生物科技有限公司，批号GB111364），兔源FN多克隆
        （ginsenoside Rb1，G-Rb1）是 人 参 的 主 要 活 性 成 分 之        抗体、兔源E-钙黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗体、小鼠源
          [14]
        一 。临床上已有报道，G-Rb1能改善早期DKD患者的                         COL-Ⅰ单克隆抗体、小鼠源Smad3单克隆抗体（武汉三
        肾功能 。此外，G-Rb1 可抑制 FN、Ⅰ型胶原蛋白（col-                    鹰 生 物 技 术 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为 15613-1-AP、
               [15]
        lagen Ⅰ，COL-Ⅰ）和TGF-β 1的表达，减轻小鼠肾组织损                  20874-1-AP、66761-1-lg、66516-1-lg），兔源磷酸化Smad3
        伤 。但 G-Rb1 是否能够抑制 TGF-β 1诱导的肾小管上                   （p-Smad3）单克隆抗体（美国 CST 公司，批号 9520），小
          [16]
                                                            鼠源β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（美国 Santa Cruz
        皮细胞发生EMT尚不明确。因此，本研究拟采用TGF-β 1
        诱导肾小管上皮细胞发生EMT，探讨G-Rb1对人肾小管                         Biotechnology 公司，批号 sc-8432），HRP 标记的山羊抗
        上皮细胞发生EMT的影响及其是否对TGF-β 1/Smad3信                     小鼠IgG二抗、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（美国Pro-
        号通路有调节作用，为 G-Rb1 治疗DKD提供参考。                         teintech Group公司，批号分别为SA00001-1、SA00001-2）；
        1 材料                                                其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
        1.1  主要仪器                                           1.3  细胞
            本研究所用的主要仪器有FORMA SERIES Ⅱ WA-                       人肾小管上皮细胞HK-2、人胚胎肾细胞HEK293均
        TER JACKET 型 CO2细胞培养箱、Multiskan GO 型全波              购自中国科学院细胞库。
        长酶标仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；Eclipset       2 方法
        S100型倒置显微镜（日本Nikon公司）；CKX41型荧光倒                     2.1  细胞培养
        置显微镜（北京元中锐科集成检测技术有限公司）；7500                             将 HEK293 细胞培养在含有 10％胎牛血清、1％青-
        Fast 型实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）仪（美                     链霉素混合液的DMEM高糖培养基中，将HK-2细胞培
        国 ABI 公 司）；Mini-protean 3 Dodeca 型 电 泳 系 统 、        养在含有10％胎牛血清、1％青-链霉素混合液的DME/F-
        ChemiDoc MP 型全能型凝胶成像系统（美国 Bio-Rad                   12培养基中。待细胞融合至80％～90％时进行传代，取
        公司）。                                                6～10代细胞进行后续实验。
        1.2 主要药品与试剂                                         2.2 HK-2细胞的形态学观察
            本研究所用的主要药品与试剂包括：G-Rb1对照品                            取对数生长期的HK-2细胞，按2×10 个/孔接种于6
                                                                                               5
        （成都曼思特生物科技有限公司，批号 41753-43-9，纯                      孔板中，常规培养24 h。将细胞分为对照组（含1‰二甲
        度≥98％），人源TGF-β1试剂（美国PeproTech公司，批号                  基 亚 砜 的 DME/F-12 培 养 基）、TGF-β 1 组（10 ng/mL
        100-21-10UG），特异性 Smad3 抑制剂 SIS3 盐酸盐（美国              TGF-β 1，质量浓度参考文献[17]设置）、SIS3组（10 nmol/L
        MCE 公 司 ，批 号 HY-13013/CS5768，纯 度 98.02％），           SIS3+10 ng/mL TGF-β 1，阳性对照药 SIS3 的浓度参考产
        DME/F-12（1 ∶ 1）基础培养基（美国 HyClone 公司，批号               品说明书设置）以及10 、20、30 μmol/L G-Rb1组（分别为
        SH30023.01），DMEM高糖培养基（美国Corning公司，批                 10、20、30 μmol/L G-Rb1+10 ng/mL TGF-β 1，G-Rb1 浓度


        ·536 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 5                                    中国药房    2022年第33卷第5期
   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35