Page 97 - 《中国药房》2022年4期
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的DMEM-F12培养基（以下简称“SFM”）中，置于37 ℃、                   黄、水飞雄黄不同质量浓度组（均为1、2.5、5、10 mg/L，浓
        5％CO2、100％相对湿度的细胞培养箱中培养（培养条件                       度设置依据同“2.4”项），每组设置 3 个复孔。各组均加
        下同），使用倒置显微镜观察其形态，每3天进行半量换                          入无血清的RPMI 1640培养基900 μL，随后空白对照组
        液，待细胞增殖成致密的悬浮球时，机械吹打制成单细                           加入 PBS 100 μL，各给药组加入相应质量浓度的药液
        胞悬液，每7天传代1次，取第5代对数生长期的悬浮球                          100 μL，混匀。分别培养 0、24 h 后，于倒置显微镜下观
        细胞作为乳腺癌干细胞进行后续实验。                                  察划痕愈合情况并拍照，计算划痕愈合率：划痕愈合率
        2.3 细胞增殖检测                                         （％）＝（1－划痕宽度 24 h/划痕宽度 0 h ）×100％。实验重复
            采用CCK-8法进行检测。取“2.2”项下对数生长期                     3次。
        的 MCF-7 亲本细胞及干细胞，分别用 SSM 和 SFM 重悬                  2.6 细胞侵袭能力检测
                               －1
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        并制成密度均为 5×10 mL 的单细胞悬液，按每孔 90                          采用Transwell侵袭实验进行检测。将matrigel与预
        µL接种于96孔板中，培养12 h后，将细胞分为空白对照                       冷的 DMEM-F12 培养基（两者体积比 1 ∶ 8）混匀后，取
        组和纳米雄黄、水飞雄黄不同质量浓度组（均为1、5、10、                       50 µL 均匀包被 Transwell 小室上膜，放入培养箱中孵育
        40、60、80 mg/L）、阿霉素 1 mg/L 组（阳性对照），给药浓              4 h。取“2.2”项下第5代对数生长期的乳腺癌干细胞，用
        度参考文献[10]及前期预实验；同时，设置含相应质量浓                        SFM重悬，以3 000 r/min离心5 min，用PBS清洗2次，随
        度药液和相应培养基、不含细胞的药物空白组以及不含                           后将细胞用无血清的 RPMI 1640 培养基重悬并制成密
                                                                        －1
        药物和细胞的空白培养基组，每组设置3个复孔。空白                           度为 1×10 mL 的单细胞悬液，按每孔 90 µL 加入小室
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        对照组加入 PBS 10 µL，各给药组加入相应质量浓度的                      内，小室外加入 SSM 700 µL。培养 4 h 后，将细胞分为
        药液 10 µL。继续培养 24 h 后，每孔加入 CCK-8 试剂 10              空白对照组、阿霉素 1 mg/L 组（阳性对照）和纳米雄黄、
        µL，继续培养 3 h，用酶标仪在 450 nm 波长处检测各孔                   水飞雄黄不同质量浓度组（均为 1、2.5、5、10 mg/L，浓度
        的光密度（optical density，OD）值并计算细胞存活率：细                设置依据同“2.4”项），每组设置 3 个复孔。空白对照组
        胞存活率（％）＝[给药组OD450 nm－药物空白组OD450 nm]/[空             加入 PBS 10 µL，各给药组加入相应质量浓度的药液 10
        白对照组OD450 nm－空白培养基组OD450 nm]×100％。实验               μL。培养 24 h 后，取出小室，弃上层液体，用 3.7％甲醛
        重复3次。                                              溶液固定 5 min，PBS 清洗；用甲醇固定 20 min，PBS 清
        2.4  细胞悬浮球形成及分化能力检测                                洗；最后用0.1％结晶紫乙醇溶液染色15 min，PBS清洗，
            采用悬浮球形成及分化实验。取“2.2”项下第 5 代                     用棉棒轻轻擦去小室内未穿过小室膜的细胞，晾干，于
        对数生长期的乳腺癌干细胞，用SFM重悬并制成密度为                          倒置显微镜下观察小室膜外层细胞并拍照，随后将小室
        1×10 mL 的单细胞悬液，按每孔 1 800 μL 接种于 6 孔                放入含 33％乙酸溶液 400 µL 的 24 孔板中，使细胞中的
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                －1
        板中，培养 12 h 后，将细胞分为空白对照组、阿霉素 1                      结晶紫全部溶解于乙酸中。将含有结晶紫的乙酸溶液
        mg/L组（阳性对照）和纳米雄黄、水飞雄黄不同质量浓度                        移入 96 孔板中，用酶标仪在 570 nm 波长处检测各孔的
        组（均为1、2.5、5、10 mg/L，给药浓度参考“2.3”项下结果                OD 值并计算相对侵袭率：相对侵袭率（％）＝（给药组
        并排除高质量浓度致细胞毒性的影响），每组设置3个复                          OD570 nm/空白对照组OD570 nm ）×100％。实验重复3次。
        孔。空白对照组加入PBS 200 µL，各给药组加入相应质                      2.7  细胞中 CD44 /CD24 细胞亚群比例检测
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        量浓度的药液200 µL。继续培养48 h后，于倒置显微镜                          采用流式细胞仪进行检测。取“2.2”项下第 5 代对
        下观察各组细胞形成悬浮球的体积并统计多细胞悬浮                            数生长期的乳腺癌干细胞，用 SFM 重悬并制成密度为
                                                                    －1
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        球（＞20个细胞）的数量。收集各组悬浮球细胞，以3 000                      6×10 mL 的单细胞悬液，按每孔 1 800 μL 接种于 6 孔
        r/min离心 5 min，用 SSM 重悬并制成密度为 1×10 mL          －1   板中。培养 12 h 后，将细胞分为空白对照组、阿霉素 1
                                                  4
        的单细胞悬液，按每孔1 000 μL接种于6孔板中，于倒置                      mg/L组（阳性对照）和纳米雄黄、水飞雄黄不同质量浓度
        显微镜下观察细胞形态。3 d后，收集贴壁细胞，用SFM                        组（均为1、2.5、5、10 mg/L，剂量设置依据同“2.4”项），每
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        重悬并制成密度为 1×10 mL         －1 的单细胞悬液，按每孔             组设置3个复孔。空白对照组加入PBS 200 µL，各给药
        1 000 μL 接种于 6 孔板中，对各组细胞形态进行观察并                    组加入相应质量浓度的药液200 μL。继续培养48 h后，
        拍照，以考察干细胞的分化能力。实验重复3次。                             收集各组乳腺癌干细胞，用 PBS 1 mL 清洗 1 次，并用
        2.5 细胞迁移能力检测                                       PBS 100 μL 重悬，加入 FITC 标记的 CD44 单克隆抗体 5
            采用划痕实验进行检测。取“2.2”项下第 5 代对数                     µL、PE标记的CD24单克隆抗体5 µL，混匀，4 ℃避光孵
        生长期的乳腺癌干细胞，用 SFM 重悬并制成密度为 2×                       育30 min，用PBS清洗3次，再用PBS 200 μL重悬，并于
                                                                                            +
          5
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        10 mL 的单细胞悬液，按每孔 1 000 μL 接种于背面划                   1 h内使用流式细胞仪检测各组CD44 /CD24 细胞亚群
              －1
        有2条横线的24孔板中，待细胞铺满孔底后，用10 µL的                       比例。实验重复3次。
        枪头在 24 孔板底垂直于横线划痕，PBS 清洗后，将细胞                      2.8 细胞上皮间质转化通路相关蛋白表达水平检测
        分为空白对照组、阿霉素1 mg/L组（阳性对照）和纳米雄                           采用 Western blot 法进行检测。取“2.2”项下第 5 代

        中国药房    2022年第33卷第4期                                               China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 4  ·475 ·
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