Page 98 - 《中国药房》2022年4期

对数生长期的乳腺癌干细胞，用SFM重悬并制成密度为
5
3×10 mL 的单细胞悬液，按每孔 1 800 μL 接种于 6 孔
－1
板中。培养 12 h 后，将细胞分为空白对照组和纳米雄
黄、水飞雄黄不同质量浓度组（均为2.5、10 mg/L，浓度设
置参考前期 Western blot 预实验结果），每组设置 3 个复
孔。空白对照组加入PBS 200 µL，各给药组加入相应质
量浓度的药液 200 μL。培养 24 h 后，收集并裂解细胞， A.血清培养3 d B.无血清培养1 d
提取总蛋白。采用 BCA 法检测蛋白浓度，加入上样缓
冲液并煮沸使蛋白变性。根据蛋白浓度，计算电泳上样
量。使用5％的浓缩胶和10％的分离胶进行十二烷基硫
酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移至
聚偏氟乙烯膜上。用5％脱脂奶粉封闭2 h，加入上皮钙
黏着蛋白、波形蛋白、GAPDH 一抗（稀释比例均为 1 ∶
C.无血清培养3 d D.无血清培养7 d
1 000）中，4 ℃孵育过夜；用 PBST 洗膜 3 次，每次 10
min，随后加入相应二抗（稀释比例为 1 ∶ 3 000），孵育 2
h；再用PBST洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL化学
发光液反应 5 min，使用凝胶成像系统进行显影。采用
Image J 1.8.0软件，以目标蛋白与内参GAPDH的灰度值
比值表示目标蛋白的表达水平。实验重复3次。
2.9 统计学分析 E.无血清培养14 d F.无血清培养21 d
采用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，采用 图 1 MCF-7 亲本细胞及其干细胞形态观察的显微图
Graphpad Prism 8.0 软件作图。计量资料满足正态分布 （×200）
以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步
表 1 各组 MCF-7 亲本细胞及其干细胞存活率比较
两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
（x±±s，n＝3，％％）
3 结果
组别 MCF-7亲 乳腺癌 组别 MCF-7亲 乳腺癌
3.1 细胞形态及生长方式观察结果 本细胞 干细胞 本细胞 干细胞
a
当使用 SSM 培养，MCF-7 亲本细胞呈类似多边形 空白对照组 99.10±3.61 98.97±2.13 阿霉素1 mg/L组 61.83±2.82 69.43±2.79 a
水飞雄黄1 mg/L组 85.77±2.80 93.60±1.20 纳米雄黄1 mg/L组 80.40±3.13 91.40±2.00
ab
a
单层贴壁生长。而使用 SFM 培养，部分 MCF-7 亲本细 水飞雄黄5 mg/L组 73.77±1.70 80.60±1.82 a 纳米雄黄5 mg/L组 65.73±2.25 74.67±1.49 ab
ab
a
胞可于培养1～3 d后形成若干体积、形态不等的细胞悬 水飞雄黄10 mg/L组 65.20±3.53 72.67±1.76 a 纳米雄黄10 mg/L组 59.93±3.12 65.23±1.31 ab
a
ab
a
ab
浮球，且培养液呈悬浮状态，细胞间连接较松散；培养 水飞雄黄40 mg/L组 48.23±4.10 54.37±1.83 a 纳米雄黄40 mg/L组 41.63±3.24 47.30±1.07 ab
a
ab
水飞雄黄60 mg/L组 31.13±1.54 42.87±1.84 a 纳米雄黄60 mg/L组 27.70±1.56 37.80±1.53 ab
5～7 d 后悬浮球体积逐渐增大，数量增多，球内细胞结 水飞雄黄80 mg/L组 23.80±2.37 33.37±2.45 a 纳米雄黄80 mg/L组 15.63±1.51 24.30±2.51 ab
a
ab
合紧密，折光性强。当7 d后进行传代，细胞可继续呈悬 a：与空白对照组比较，P＜0.01；b：与相同质量浓度的水飞雄黄组
浮球状生长，表明在连续的无血清培养条件下，部分 比较，P＜0.01
MCF-7 亲本细胞仍能存活并增殖形成具有自我更新能
浮球体积缩小；与相同质量浓度的水飞雄黄组比较，纳
力的肿瘤干细胞悬浮球。结果见图1。
米雄黄组对细胞悬浮球形成能力的抑制作用更强（P＜
3.2 纳米雄黄对 MCF-7 亲本细胞及其干细胞增殖的
0.01）。结果见表2、图2。
影响
表2 各组乳腺癌干细胞形成的多细胞悬浮球数量比较
与空白对照组比较，水飞雄黄、纳米雄黄各给药组
（x±±s，n＝3，个）
MCF-7亲本细胞及其干细胞（两者1 mg/L组乳腺癌干细
组别 多细胞悬浮球数量 组别 多细胞悬浮球数量
胞除外）的存活率均显著降低（P＜0.01），且有随药物质 空白对照组 182.75±3.27 阿霉素1 mg/L组 30.25±1.92 a
量浓度增加而降低的趋势；与相同质量浓度的水飞雄黄 水飞雄黄1 mg/L组 121.75±2.86 a 纳米雄黄1 mg/L组 91.75±2.38 ab
组比较，纳米雄黄 5～80 mg/L 组 MCF-7 亲本细胞及其 水飞雄黄2.5 mg/L组 96.25±2.38 a 纳米雄黄2.5 mg/L组 79.52±2.96 ab
水飞雄黄5 mg/L组 44.51±2.92 a 纳米雄黄5 mg/L组 17.54±1.86 ab
干细胞的存活率更低（P＜0.01）。结果见表1。 水飞雄黄10 mg/L组 16.51±1.12 a 纳米雄黄10 mg/L组 7.25±2.83 ab
3.3 纳米雄黄对乳腺癌干细胞悬浮球形成及分化能力 a：与空白对照组比较，P＜0.01；b：与相同质量浓度的水飞雄黄组
的影响 比较，P＜0.01
与空白对照组比较，水飞雄黄、纳米雄黄各给药组 对各组悬浮球细胞进行诱导分化，培养 24 h 后，可
形成的多细胞悬浮球数量均显著减少（P＜0.01），且悬 见细胞开始贴壁，形态呈类似多边形，与 SSM 条件下培
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