Page 72 - 《中国药房》2022年1期

并计算大鼠的右心肥厚指数（right ventricular hypertro- 条带光密度比值表示IL-17的蛋白表达水平。
phy index，RVHI）来间接反映肺动脉平均压力：RVHI＝ 2.7 统计学分析
RV的质量/（LV+S）的质量。 采用 SPSS 23.0 统计软件进行数据分析，计量资料
2.4 肺内小动脉和心肌组织形态改变的观察 满足正态分布则以x±s表示，多个样本均数间比较采用
处死大鼠并取出其全肺，分离左右肺组织，以生理 单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。检验
盐水冲洗，然后用 4％多聚甲醛固定肺组织，石蜡包埋， 水准α＝0.05。
常规石蜡切片后行 HE 染色，光学显微镜下观察肺内小 3 结果
动脉的形态改变。于右心室尖取 1.0 cm×0.3 cm 大小的 3.1 各组大鼠mPAP、RVHI
游离心肌组织，浸入 10％甲醇固定，常规石蜡切片后行 本研究结果显示，野百合碱组大鼠mPAP为（33.5±
HE染色，光学显微镜下观察心肌组织的形态改变。 5.16）mmHg，正 常 对 照 组 大 鼠 mPAP 为（12.3 ± 1.98）
2.5 肺组织中IL-17 mRNA表达水平的检测 mmHg，野百合碱组大鼠 mPAP 升高 10 mmHg 以上，提
采用RT-PCR法进行检测。按照Trizol RNA提取试 示本实验造模成功。黄芪多糖低剂量组和黄芪多糖高
剂盒说明书步骤提取大鼠肺组织总RNA，采用紫外分光 剂量组大鼠mPAP、RVHI较野百合碱组均显著降低（P＜
光度法及琼脂糖凝胶电泳法分析提取RNA的纯度及完 0.01）；黄芪多糖高剂量组大鼠mPAP、RVHI较黄芪多糖
整性。依据TaKaRa DRR037A反转录试剂盒说明书，以 低剂量组均显著降低（P＜0.01）。结果见表2。
1 μg总RNA为模板，合成cDNA。按照TaKaRa D334A扩 表2 各组大鼠mPAP、RVHI检测结果（x±±s，n＝15）
增试剂盒说明书建立反应体系，以 PCR 仪进行扩增。 组别 mPAP/mmHg RVHI
IL-17基因反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s， 正常对照组 12.3±1.98 a 0.326±0.032 a
野百合碱组 33.5±5.16 0.694±0.053
57.8 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 35 s，32 个循环；72 ℃ 10 黄芪多糖低剂量组 26.6±2.32 a 0.432±0.023 a
min，4 ℃ 2 min。β-actin 基因反应条件：94 ℃预变性 5 黄芪多糖高剂量组 19.6±3.36 ab 0.373±0.021 ab
min，94 ℃变性30 s，57.4 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 50 s，28 a：与野百合碱组比较，P＜0.01；b：与黄芪多糖低剂量组比较，P＜
个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。扩增产物进行琼脂糖 0.01
3.2 各组大鼠肺动脉的病理形态
凝胶电泳，以凝胶成像系统扫描成像，采用Quantity One
正常对照组大鼠肺组织HE染色后可见肺动脉光滑
软件进行条带密度分析，以目的基因条带与内参基因条
平整，无肌型动脉；野百合碱组大鼠肺动脉平滑肌细胞
带的比值表示IL-17的mRNA表达水平。PCR引物序列
明显增生；黄芪多糖低剂量组大鼠肺动脉平滑肌细胞增
及产物长度见表1。
生肥大，程度较野百合碱组轻；黄芪多糖高剂量组大鼠
表1 PCR引物序列及产物长度
肺动脉平滑肌细胞增生肥大，程度较黄芪多糖低剂量组
基因 引物序列 产物长度/bp
IL-17 上游：5′-AGCGTGTCCAAACACTGAGG-3′ 225 轻。各组大鼠肺动脉病理形态显微图见图1。
下游：5′-ACGTGGAACGGTTGAGGTAG-3′
β-actin 上游：5′-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′ 594
下游：5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3′
2.6 肺组织中IL-17蛋白表达水平的检测
采用 Western blot 进行检测。按凯基膜蛋白提取试
剂盒说明书步骤提取大鼠肺组织蛋白，用BCA法进行蛋
白定量并绘制标准蛋白曲线；调整蛋白浓度后按体积比
4 ∶ 1加入蛋白上样缓冲液×5次，100 ℃煮沸5 min。使用 A.正常对照组 B.野百合碱组
DYY-Ⅲ-6B 型稳压稳流电泳仪，每泳道加 50 μg 蛋白进
行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（8％分离胶，
5％浓缩胶）；用湿转法转移至聚偏氟乙烯膜上，以PBST
配制的 5％脱脂奶粉溶液室温封闭 1 h；加入 IL-17 一抗
（稀释度为1∶800）及内参β-actin一抗（稀释度为1∶3 000），
4 ℃孵育过夜；PBST洗膜10 min×3次后加入二抗（稀释
度为 1 ∶ 8 000）室温孵育 2 h；PBST 洗膜 10 min×3 次后， C.黄芪多糖低剂量组 D.黄芪多糖高剂量组
采用 ECL 显色。每组实验至少重复 3 次。图像扫描后 箭头所指处：病理形态改变
用 Quantity One 软件分析，以目的蛋白条带与内参蛋白 图1 各组大鼠肺动脉病理形态显微图（HE染色，×200）

·66 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 1 中国药房 2022年第33卷第1期