Page 41 - 《中国药房》2022年1期

2.1.10 相似度评价 将16批不同产地吴茱萸水提物样 表明参考序列和比较序列的相关性较大） [14－16] ；然后将
品的UPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评 关联度按大小顺序进行排序，得到关联序，结果见表4。
价系统（2012A 版）》中进行相似度评价。结果，16 批样 由表 4 可知，27 个共有峰与 L02 细胞抑制率的关联
品的相似度在 0.375～0.995 范围内，表明不同产地的吴 度在0.716 4～0.878 0之间；其中，关联度大于0.8的共有
茱萸水提物存在一定差异，详见表2。 峰有 18 个，依次为峰 8＞峰 3＞峰 23＞峰 7＞峰 4＞峰 9
2.2 吴茱萸水提物的体外肝毒性考察 （绿原酸）＞峰 12（咖啡酸）＞峰 2＞峰 19（去氢吴茱萸
2.2.1 细胞培养 将 L02 细胞以含 10％胎牛血清、1％ 碱）＞峰 6＞峰 15＞峰 5（新绿原酸）＞峰 1＞峰 17（金丝
青链霉素双抗的 RPMI-1640 培养基（以下简称“培养 桃苷）＞峰21＞峰26＞峰20＞峰14，表明这18个共有峰
基”），在37 ℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。当细胞生 与肝毒性的关联性较大。
长至融合度为 80％～90％时，以胰酶消化传代，用于后 2.3.2 偏最小二乘回归分析 将吴茱萸水提物UPLC指
续实验。 纹图谱中各共有峰峰面积作为自变量（X）、L02细胞抑制
2.2.2 细胞抑制率的检测 参考文献[11－13]方法进行 率作为因变量（Y），将峰面积归一化处理后导入SIMCA-P
吴茱萸水提物的体外肝毒性评价。取对数生长期的L02 13.5软件，进行偏最小二乘回归分析，结果见图4、图5。
4
－1
细胞，调整细胞密度为 5×10 mL ，按每孔 100 μL 接种 由图 4 可知，峰 1～15、峰 17、峰 19～26 的回归系数
于96孔板，培养24 h后，吸弃培养基；将细胞分为阴性组 为正，表明这些共有峰与吴茱萸的肝毒性作用呈正相
[17]
和吴茱萸 S1～S16 水提物组（0.5 mg/mL，药物浓度根据 关 ；峰 16、18、27 的回归系数为负，表明这 3 个共有峰
本课题组前期预实验设置），每组设6个复孔，阴性组加 与吴茱萸的肝毒性作用呈负相关。一般认为，当变量重
入培养基 200 μL，各给药组加入相应含药培养基 200 要性投影（variable importance projection，VIP）＞1 时，自
[18]
μL。各组细胞培养48 h后，每孔弃上清液，以PBS洗涤1 变量在解释因变量时具有重要意义 。由图 5 可知，回
次，加入 10％CCK-8 试剂 100 μL，培养 2 h 后，采用酶标 归系数为正且VIP 值＞1的色谱峰共14个，按回归系数
仪于450 nm波长处测定每孔光密度（OD）值并计算细胞 由大到小依次为峰 8＞峰 3＞峰 23＞峰 2＞峰 7＞峰 4＞
抑制率（％）[细胞抑制率＝（1－OD 给药组平均值/OD 阴性组平均值）× 峰12＞峰9＞峰19＞峰5＞峰17＞峰26＞峰10＞峰15，
100％]。采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，数据 表明这14个共有峰对吴茱萸的肝毒性均有显著影响。
均以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间 2.3.3 综合分析 将灰色关联度分析中关联度＞0.8、偏
两两比较采用 Dunnet 检验，检验水准α＝0.05。结果显 最小二乘回归分析中回归系数＞0 且 VIP 值＞1 的共有
[19]
示，与阴性组比较，吴茱萸S1～S16水提物组细胞的OD 峰进行整合 ，得到重叠的共有峰 13 个，分别为峰 8、峰
值 均 显 著 降 低（P＜0.05 或 P＜0.01），细 胞 抑 制 率 在 3、峰23、峰2、峰7、峰4、峰12（咖啡酸）、峰9（绿原酸）、峰
6.68％～67.95％之间，详见表3。 19（去氢吴茱萸碱）、峰5（新绿原酸）、峰17（金丝桃苷）、
2.3 谱-毒关系分析 峰 26、峰 15，表明这些共有峰所代表的化学成分与吴茱
2.3.1 灰色关联度分析 以“2.2.2”项下 L02 细胞抑制 萸的肝毒性相关性强。另外，经上述两种方法分析后发
率为参考序列，以吴茱萸水提物UPLC指纹图谱中各共 现，峰 8 与吴茱萸的肝毒性相关性排第 1 位，由此推测，
有峰峰面积为比较序列，采用均值法对参考数列和比较 峰8所对应的化合物可能是吴茱萸水提物的重要肝毒性
数列进行无量纲化并计算关联度（当关联度大于0.8时， 成分。
表2 16批吴茱萸水提物的相似度评价结果
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 R
S1 1.000 0.775 0.995 0.582 0.796 0.842 0.995 0.858 0.614 0.638 0.670 0.785 0.800 0.719 0.959 0.674 0.895
S2 0.775 1.000 0.756 0.909 0.770 0.804 0.780 0.616 0.920 0.921 0.661 0.755 0.558 0.692 0.708 0.657 0.944
S3 0.995 0.756 1.000 0.581 0.780 0.830 0.989 0.859 0.613 0.637 0.647 0.771 0.806 0.701 0.966 0.656 0.889
S4 0.582 0.909 0.581 1.000 0.600 0.636 0.583 0.412 0.998 0.994 0.457 0.602 0.375 0.540 0.548 0.486 0.851
S5 0.796 0.770 0.780 0.600 1.000 0.977 0.794 0.582 0.631 0.655 0.852 0.990 0.521 0.972 0.713 0.921 0.867
S6 0.842 0.804 0.830 0.636 0.977 1.000 0.841 0.615 0.670 0.698 0.828 0.980 0.564 0.930 0.762 0.888 0.898
S7 0.995 0.780 0.989 0.583 0.794 0.841 1.000 0.867 0.614 0.638 0.683 0.783 0.813 0.718 0.954 0.675 0.897
S8 0.858 0.616 0.859 0.412 0.582 0.615 0.867 1.000 0.434 0.450 0.663 0.567 0.961 0.535 0.908 0.583 0.751
S9 0.614 0.920 0.613 0.998 0.631 0.670 0.614 0.434 1.000 0.998 0.477 0.634 0.392 0.568 0.573 0.509 0.871
S10 0.638 0.921 0.637 0.994 0.655 0.698 0.638 0.450 0.998 1.000 0.495 0.660 0.408 0.589 0.598 0.531 0.885
S11 0.670 0.661 0.647 0.457 0.852 0.828 0.683 0.663 0.477 0.495 1.000 0.836 0.650 0.873 0.661 0.944 0.757
S12 0.785 0.755 0.771 0.602 0.990 0.980 0.783 0.567 0.634 0.660 0.836 1.000 0.507 0.962 0.706 0.921 0.861
S13 0.800 0.558 0.806 0.375 0.521 0.564 0.813 0.961 0.392 0.408 0.650 0.507 1.000 0.485 0.895 0.561 0.704
S14 0.719 0.692 0.701 0.540 0.972 0.930 0.718 0.535 0.568 0.589 0.873 0.962 0.485 1.000 0.646 0.935 0.806
S15 0.959 0.708 0.966 0.548 0.713 0.762 0.954 0.908 0.573 0.598 0.661 0.706 0.895 0.646 1.000 0.655 0.861
S16 0.674 0.657 0.656 0.486 0.921 0.888 0.675 0.583 0.509 0.531 0.944 0.921 0.561 0.935 0.655 1.000 0.774
R 0.895 0.944 0.889 0.851 0.867 0.898 0.897 0.751 0.871 0.885 0.757 0.861 0.704 0.806 0.861 0.774 1.000

中国药房 2022年第33卷第1期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 1 ·35 ·