Page 27 - 《中国药房》2022年1期
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相对湿度为50％～60％、每天的光照时间为12 h。本实                       化物酶活性10 min；加入ICAM-1一抗（稀释比例1∶100）、
        验过程满足动物实验“3R”原则。                                   VCAM-1一抗（稀释比例1 ∶ 125）、PCNA一抗（稀释比例
        2 方法                                               1∶200），4 ℃孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例1∶500），
        2.1 分组、造模与给药                                       37 ℃孵育 30 min；进行磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤、DAB
            小鼠经过 2 周的适应性喂养后进行正式实验。                         显色、苏木精染色、封片后，在光学显微镜下检测。
        以 8 只 C57BL/6J 小鼠作为正常组；将 40 只 ApoE         －/－ 小   ICAM-1 和 VCAM-1 主要在胞浆中表达，胞浆阳性染色
        鼠随机分为模型组，田蓟苷低、中、高剂量组[2.1、3.5、                      呈棕黄色。通过 Image-Pro Plus 6.0 软件计算棕黄色部
        7.0 mg/（kg·d）]  [11]  和辛伐他汀组[阳性对照药物，3.5            位的平均光密度（IOD）值和阳性表达蛋白的分布面
                  [15]
        mg/（kg·d）] ，每组8只。正常组小鼠饲以普通饲料，其                     积，计算 2 种蛋白的阳性率[阳性率（％）＝IOD 值/阳性
        余各组小鼠均通过饲以高脂饲料（0.75％胆固醇、15％猪                       表达蛋白的分布面积×100％]。PCNA 主要在细胞核中
        油和 84.25％基础饲料）的方式建立 AS 模型，连续饲养                     表达，细胞核阳性染色呈棕色，阴性染色呈蓝色。通过
        12 周 。同时，各给药组小鼠灌胃相应药物（均以生理                         Image-Pro Plus 6.0 软件计数阳性细胞个数和视野中所
            [13]
        盐水为溶剂溶解），正常组和模型组小鼠灌胃生理盐水，                          有细胞个数，并计算 PCNA 阳性率[阳性率（％）＝（阳性
        灌胃体积均为10 mL/kg，每天1次，连续12周。                         细胞个数/视野中所有细胞个数）×100％]。
        2.2 样本取材及处理                                        2.7  主 动 脉 中 MMP-2、MMP-9、TGF-β 1、Smad2、
            末次灌胃 24 h 后，小鼠先禁食不禁水 12 h，然后摘                  Smad3 mRNA表达的检测
        眼球取血。将血样置于含肝素钠的抗凝管中，以 3 000                            采用 qRT-PCR 法进行检测。取“2.2”项下冻存的主
        r/min离心10 min，分离血浆并分装。将部分血浆用于血                     动脉，常规解冻后，按动物组织总RNA抽提试剂盒方法
        脂指标检测；部分血浆于－80 ℃保存，备用。取血后将                         提取组织中的总 RNA；验证其纯度后，按 cDNA 逆转录
        小鼠处死，开胸剪取主动脉，剥离外膜脂肪组织，然后用                          试剂盒方法合成 cDNA，并以 cDNA 为模板进行 PCR 扩
        预冷的灭菌生理盐水冲洗主动脉。取洗净后的主动脉                            增。反应体系（共 20 μL）：2×QuantiNova SYBR Green
        根部（长约1.0 cm），置于4％多聚甲醛溶液中固定；其余                      PCR Master mix 10 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA 模
        的主动脉用锡箔纸包裹并标记好后迅速置于液氮中冷                            板 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性 1
        冻，再于－80 ℃保存，备用。                                    min；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火/延伸 15 s，共 40 个循环。
        2.3  血浆中血脂指标水平检测                                   以 GAPDH 为内参，采用 2        － Δ Δ Ct 法计算各目的基因的
            取“2.2”项下血浆，采用全自动生化分析仪检测血浆                      mRNA表达水平。引物序列及产物扩增长度见表1。
        中总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyce-                    表1 引物序列及产物扩增长度
        ride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein          基因名称             引物序列                产物扩增长度/bp
        cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-densi-            MMP-2     上游：5′-ACACTGGGACCTGTCACTCC-3′  122
                                                                      下游：5′-TGTCACTGTCCGCCAAATAA-3′
        ty lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。
                                                            MMP-9     上游：5′-AGACGACATAGACGGCATCC-3′  116
        2.4  血浆中 Ox-LDL、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平                      下游：5′-TGGGACACATAGTGGGAGGT-3′
        检测                                                  TGF-β1    上游：5′-CAATTCCTGGCGTTACCTTG-3′  122
                                                                      下游：5′-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3′
            采用 ELISA 法进行检测。取“2.2”项下血浆，按照                    Smad2     上游：5′-GGAACCTGCATTCTGGTGTT-3′  118
        相应试剂盒说明书方法操作，采用酶标仪在450 nm波长                                   下游：5′-CGAGTTTGATGGGTCTGTGA-3′
                                                            Smad3     上游：5′-CACAGCCACCATGAATTACG-3′  120
        处测定血浆中 Ox-LDL、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α的
                                                                      下游：5′-TGGAGGTAGAACTGGCGTCT-3′
        水平。                                                 GAPDH     上游：5′-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3′  178
        2.5 主动脉病理形态学变化观察                                              下游：5′-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3′
            采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察。取 4％多                      2.8  主动脉中 TGF-β 1、Smad2/3、p-Smad2/3 蛋白表达
        聚甲醛溶液固定的主动脉，常规制备石蜡切片（厚度约                           的检测
        5 μm），行常规HE染色后，置于光学显微镜下观察。                             采用Western blot法进行测定。取“2.2”项下冻存的
        2.6 主动脉中ICAM-1、VCAM-1、PCNA蛋白表达检测                   主动脉，常规解冻后，采用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶
            采用免疫组化法进行测定。取4％多聚甲醛溶液固                         抑制剂的 RIPA 裂解液提取组织中的总蛋白；测定蛋白
        定的主动脉，常规制备石蜡切片（厚度约5 μm），60 ℃脱                      的浓度和纯度后，将蛋白进行高温变性。取变性后蛋白
        蜡后，在100 ℃下用pH 6.0的柠檬酸盐抗原修复液修复                      进行 10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离
        5 min，然后在25 ℃下用3％过氧化氢溶液阻断内源过氧                      胶电压 100 V、浓缩胶电压 80 V，电泳时间 2 h），湿法转


        中国药房    2022年第33卷第1期                                                China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 1  ·21 ·
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