Page 19 - 《中国药房》2021年23期

度[0（作为对照组）、0.001、0.01、0.1、1、10 PFU/cell，滴度 1。另外，当M1病毒滴度大于1 PFU/cell时，其对细胞存
参考文献[13]设置]的M1病毒进行干预，另设不加细胞、 活率的影响趋于稳定，故选择0.001、0.01、0.1 PFU/cell的
不加病毒的空白组，每组设4个复孔。各组细胞培养48 h 滴度进行后续实验。
后，加入 MTT 试剂（5 mg/mL）20 μL，继续培养 3 h；弃去 表1 各组细胞存活率的测定结果（x±±s，n＝4）
上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL，然后采用多 Tab 1 Survival rate of cells in each group（x±±s，n＝4）
功能微孔板检测仪于 570 nm 波长处检测各孔吸光度 组别 细胞存活率，％ 组别 细胞存活率，％
（OD），并计算细胞存活率[细胞存活率＝（OD 给 药 组－ 对照组（0 PFU/cell） 100±3.91 M1病毒 0.1 PFU/cell组 20.64±2.47 ＊
OD 空白组）/ OD 对照组×100％]。以 GraphPad Prism 8 软件计 M1病毒0.001 PFU/cell组 80.35±6.34 ＊ M1病毒 1 PFU/cell组 14.92±2.13 ＊
M1病毒 0.01 PFU/cell组 58.02±2.93 ＊ M1病毒 10 PFU/cell组 15.30±3.11 ＊
算M1病毒的半数抑制浓度（IC50 ）。
＊
注：与对照组比较，P＜0.01
2.4 C-33A细胞凋亡率以及病毒感染率的检测
Note：vs. control group，P＜0.01
＊
采 用 流 式 细 胞 仪 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期 的
3.2 M1 病毒对 C-33A 细胞凋亡率及病毒感染率的
C-33A 细胞适量，经胰酶消化后，将密度调整为 5×10 4
影响
－1
mL ，按2 mL/孔接种于12孔板；培养24 h后，将细胞分
与对照组比较，M1 病毒低、中、高剂量组细胞凋亡
为 对 照 组（0 PFU/cell）和 M1 病 毒 低 、中 、高 剂 量 组
率及感染率均显著升高（P＜0.01）。结果见表 2、图 1、
（0.001、0.01、0.1 PFU/cell，滴度根据“2.3”项下结果设
图2。
置），每组设4个复孔。对照组加入VP-SFM培养基，M1
表 2 各组细胞凋亡率和感染率的检测结果（x±±s，
病毒各剂量组加入相应滴度病毒。各组细胞继续培养
n＝4）
48 h 后，按细胞凋亡检测试剂盒说明书方法操作，采用
Tab 2 Apoptotic rate and infection rate of cells in
流式细胞仪检测细胞凋亡率；同时通过 M1 病毒自带的
each group（x±±s，n＝4）
GFP标签，检测其对C-33A细胞的感染率。
2.5 C-33A 细胞中内质网应激通路相关蛋白及凋亡相 组别 凋亡率，％ 感染率，％
对照组 2.48±1.66 0
关蛋白表达水平的检测
M1病毒低剂量组 5.08±0.14 ＊ 8.96±0.08 ＊
采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的 M1病毒中剂量组 16.39±0.19 ＊ 61.22±1.14 ＊
C-33A 细胞适量，经胰酶消化后，将密度调整为 3×10 5 M1病毒高剂量组 73.80±1.19 ＊ 59.68±0.72 ＊
－1
mL ，按 3 mL/孔接种于 6 孔板；培养 24 h 后，按“2.4”项 注：与对照组比较，P＜0.01
＊
＊
下方法分组与给药，每组设4个复孔。各组细胞继续培 Note：vs. control group，P＜0.01
养 48 h 后，收集细胞并进行裂解，以获取蛋白。采用 10 6 10 6
BCA 法测定蛋白浓度后，煮沸 5 min 使其变性；取变性
10 5 10 5
后蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转
膜，以 5％的 BSA 封闭；加入 CHOP、caspase-12、cleaved- PI 10 4 PI 10 4
caspase-3、caspase-3、β-tubulin一抗（稀释度均为1∶1 000）， 10 3 10 3
于4 ℃孵育过夜；以TBST缓冲液洗膜3次、每次5 min，然
10 2 10 2
后加入相应二抗（稀释度均为1∶1 000），于室温孵育1 h； 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6
AnnexinⅤ AnnexinⅤ
经 ECL 化学发光试剂显色后，置于凝胶成像仪上成像。 A.对照组 B. M1病毒低剂量组
采用 Image Lab 4.0 软件进行分析，以目的蛋白与内参 10 6 10 6
β-tubulin蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
10 5 10 5
2.6 统计学方法
采用SPSS 19.0 统计软件进行统计。数据以x±s表 PI 10 4 PI 10 4
示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采 10 3 10 3
用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
3 结果 10 2 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 2 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6
AnnexinⅤ AnnexinⅤ
3.1 M1病毒对C-33A细胞存活率的影响 C. M1病毒中剂量组 D. M1病毒高剂量组
与对照组比较，M1 病毒处理组细胞存活率均显著 图1 各组细胞凋亡的流式散点图
降低（P＜0.01），且呈剂量依赖趋势；M1 病毒对 C-33A Fig 1 Flow cytometry scatter plot of the apoptosis of
细胞的 IC50 为（0.015 6±0.002 4）PFU/cell。结果见表 cells in each group

中国药房 2021年第32卷第23期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23 ·2829 ·