Page 18 - 《中国药房》2021年23期
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宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤，也是威胁人类生命                          FXP023-050）购自北京四正柏生物科技有限公司；ECL
        安全的主要疾病。《2020 年全球癌症报告》显示：宫颈癌                        发光液（批号 WBKLS0100）购自美国 Millipore 公司；胎
        发病率在女性癌症中排名第 2 位，发病年龄呈年轻化                           牛血清（批号 B21001）购自中山康天晟合生物技术有限
        趋势；2020 年全球宫颈癌新发病例超过 60 万例，死亡                       公司；胰酶、青链霉素、DMEM 培养基、VP-SFM 培养基
        病例超过 34 万 。目前，早期宫颈癌的治疗效果较好，                        （批号分别为25300062、15070063、11965118、11681020）
                     [1]
        但晚期宫颈癌患者生存质量低、病死率居高不下                       [2－3] 。  均 购 自 美 国 Gibco 公 司 ；牛 血 清 白 蛋 白（BSA，批 号
        因此，晚期宫颈癌的治疗已经成为临床工作的难点和重                            021998625）购自广州威佳科技有限公司；鼠源C/EBP 同
        点，亟须新的安全有效的临床方案、策略或者药物来                             源蛋白（CHOP）单克隆抗体（批号 2895S）、兔源胱天蛋
        治疗。                                                 白酶12（caspase-12）多克隆抗体（批号35965）、兔源β-微
            溶瘤病毒是一类天然的或经过基因修饰的病毒，可                          管蛋白（β-tubulin）单克隆抗体（批号 2128S）、兔源 cas-
        特异性地在肿瘤细胞中复制，然后通过直接裂解细胞或                            pase-3 多克隆抗体（批号 9662）、兔源活化的 caspase-3
        者激活免疫来杀伤肿瘤细胞，而不损伤正常细胞                       [4－5] 。  （cleaved-caspase-3）单克隆抗体（批号 9664）、辣根过氧
        近年来溶瘤病毒疗法发展迅速，20余种病毒正在或者已                           化物酶（HRP）标记的马抗鼠免疫球蛋白 G（IgG）二抗
        经完成临床研究，且均表现出良好的安全性                    [4，6] ；现已被  （批号 7076S）、HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（批号
        中国以及多个欧美国家批准上市，主要用于治疗鼻咽                             7074S）均购自美国Cell Signaling Technology公司；其余
        癌、晚期黑色素瘤 。相关研究报道证实，单纯疱疹病                            试剂为实验室常用规格，水为纯净水。
                        [7]
        毒、新城疫病毒可杀伤宫颈癌细胞               [8－9] 。由此可知，溶瘤        1.3 细胞
        病毒为抗宫颈癌药物研发提供了新的方向。                                     本研究所用人宫颈癌细胞 C-33A 购自中国科学院
            溶瘤病毒 M1（以下简称“M1 病毒”）属于披膜病毒                      上海生科院细胞资源中心，非洲绿猴肾细胞 Vero、仓鼠
        科甲病毒属盖塔样病毒，是研究者于1964年从库蚊属蚊                          肾成纤维细胞BHK-21购自美国ATCC细胞库。
                           [10]
        虫中分离得到的病毒 。甲病毒作为载体已在病毒性                             1.4  病毒
        疾病的肿瘤疫苗、核酸疫苗、基因治疗等方面得到了大                                本研究所用 M1 病毒来源于中国典型培养物保藏
               [11]
        量应用 ，这提示 M1 病毒有成为新型抗肿瘤药物的                           中心。
        潜力。                                                 2 方法
            内质网是细胞内蛋白质合成、折叠的重要“车间”，                         2.1  细胞的复苏、培养及传代
        当细胞受到过度刺激时，大量未折叠或错误折叠的蛋白                                将细胞冻存管从液氮罐中移出，置于 37 ℃水浴条
        质堆积于内质网，从而诱发内质网应激；当剧烈的、长时                           件下快速融化，移出冻存液于离心管中；加入DMEM培
        程的内质网应激不能得到缓解时，就会引起细胞凋                              养基（含 10％胎牛血清和 1％青链霉素），以 1 200 r/min
          [12]
        亡 。M1病毒是否可通过作用于内质网诱导宫颈癌细                            离心 5 min，弃上清液；以 DMEM 培养基重悬细胞，再移
        凋亡，尚不明确。基于此，本研究拟基于内质网应激通                            入培养瓶或培养皿中，置于 37 ℃、5％ CO2的细胞培养
        路，研究M1病毒对宫颈癌细胞凋亡的诱导作用及机制，                           箱中培养（以下培养条件相同）。当细胞融合度达
        以期为治疗晚期宫颈癌的新型药物开发提供参考。                              80％～90％时，以胰酶消化传代，然后取对数生长期的
        1 材料                                                细胞用于后续实验。
        1.1 主要仪器                                            2.2 M1病毒的扩增培养
            本研究所用主要仪器有：CytoFLEX 型流式细胞仪                          采用非洲绿猴肾细胞Vero来扩增M1病毒。将Vero
        （美国 Beckman Coulter 公司），Synergy H1 型多功能微            细胞接种于100 mm的培养皿中，置于37 ℃、5％ CO2的
        孔板检测仪（美国BioTek公司），MicroCL 21型台式低温                   细胞培养箱中培养至融合度达90％；然后将培养基更换
        高速离心机、Forma 310 型CO2细胞培养箱（美国Thermo                  为 VP-SFM 培养基，加入 M1 病毒母液（1×10 PFU/mL）
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        Fisher Scientific 公司），TE-2000 型倒置相差荧光显微镜            20 μL，待 80％Vero 细胞裂解后（培养 48～60 h 后），以
                                      +
        （日本 Nikon 公司），ChemiDoc XRS System 型凝胶成像             1 200 r/min离心5 min，取上清液混匀分装后，于－80 ℃
        仪、Mini-PROTEAN Tetra 型电泳转膜仪（美国 Bio-Rad              条件下保存备用。
        公司）。                                                2.3 C-33A细胞存活率的检测
        1.2  主要药品与试剂                                            采用 MTT 法进行检测。取对数生长期的 C-33A 细
            MTT 试剂（批号 T100896）购自上海阿拉丁生化科                    胞适量，经胰酶消化后，将密度调整为 3×10 mL ，按
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        技 股 份 有 限 公 司 ；细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒（批 号                100 μL/孔接种于 96 孔板，培养过夜；然后加入不同滴

        ·2828 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23                                 中国药房    2021年第32卷第23期
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