Page 23 - 《中国药房》2021年23期
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肝纤维化是慢性肝损伤进展为肝硬化的必经阶段，                         成试剂盒、SuperReal 荧光定量预混试剂（北京天根生化
        主要表现为细胞外基质（ECM）的异常沉积，对肝脏功能                         科技有限公司，批号分别为 U8305、S8129）；兔抗大鼠
                    [1]
        具有重要影响 。相关研究发现，药物可通过作用于转                           α-SMA 多克隆抗体、兔抗大鼠 GAPDH 多克隆抗体、兔
        化生长因子β（TGF-β）/Smad、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/                抗大鼠 CollagenⅠ多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限
        蛋白激酶B（Akt）等信号通路来降低肝组织中ECM的异                        公司，批号分别为00075696、00075847、00066288）；兔抗
        常沉积，从而发挥治疗肝纤维化的目的 。肝星状细胞                           大鼠 PI3K 多克隆抗体、兔抗大鼠 Akt 多克隆抗体、兔抗
                                          [2]
       （HSC）是肝脏中关键的纤维化效应细胞，当其活化后，                          大鼠PTEN多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，
        可在肝脏内产生过多的ECM，从而导致肝纤维化                   [3－4] 。   批 号 分 别 为 bs-10657R、bs-6951R、bs-0748R）；Dylight
            蒙药传统方剂额力根-7由蓝盆花、红花、人工牛黄、                       800 标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗（美国
        石膏、香青兰、瞿麦、五灵脂等7味药材组成，具有清肝热                         Abbkine 公司，批号 ATSMR2201）；Annexin Ⅴ-FITC 细
        的作用，临床可用于治疗黄疸、肝区疼痛、肝纤维化                            胞凋亡试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（上海
        等 。但额力根-7 仅有临床应用经验，并无具体药理机                         碧云天生物技术有限公司，批号分别为 092120201021、
          [5]
        制研究，从而使其推广受限。                                      081820200917）；MTT 试剂盒（北京索莱宝科技有限公
            α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在HSC处于不活化的静                    司，批号20210727）；PCR引物由生工生物工程（上海）股
        止状态时不表达或低表达 ；Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）                     份有限公司设计合成（PCR 引物序列及产物长度见表
                              [6]
        是 ECM 的主要组成部分之一，在 HSC 活化时其表达逐                      1）；其余试剂为实验室常用规格，水为超纯水。
              [7]
        渐增强 。因此，通过测定二者含量能够反映出肝纤维                                     表1 PCR引物序列及产物长度
        化的病理情况。相关研究发现，PI3K/Akt信号通路的激                         Tab 1 PCR primary sequence and product length
        活可促使HSC活化，从而影响ECM的产生和降解，并和                          基因          引物序列（5′→3′）              产物长度，bp
                                                            Collagen Ⅰ  上游：TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG  145
        众多致纤维化因子发生关联 。磷酸酯酶与张力蛋白同
                                [8]
                                                                        下游：GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCAC
        源物（PTEN）是 PI3K 活化的主要负调控因子，能抑制                       α-SMA       上游：CATCCACGAAACCACCTA      431
        PI3K 通 路 下 游 蛋 白 的 激 活 ，如 Akt 和 蛋 白 激 酶 C                       下游：GGGCAGGAATGATTTGGA
                                                            PI3K        上游：GCTGTTGATAGACCACCGCTTCC  89
              [9]
       （PKC） 。但额力根-7是否能通过PI3K/Akt信号通路发
                                                                        下游：TGCCCTGTTCCTCTGCCTTCC
        挥治疗肝纤维化的作用，尚不明确。                                    Akt         上游：CAAGCACCGTGTGACCATGA    171
            基于此，本研究拟采用大鼠HSC-T6细胞为对象 ，                                   下游：TCAGTAAGCGTGTGGGCAAC
                                                     [10]
                                                            PTEN        上游：TTGAAGACCATAACCCACCACAGC  134
        从细胞实验层面研究额力根-7的抗肝纤维化作用；再结                                       下游：CATTACACCAGTCCGTCCTTTCCC
        合动物实验，进一步探讨额力根-7抗肝纤维化的作用及                          1.3  动物
        机制，以期为该方剂抗肝纤维化的机制阐明提供实验                                本研究所用动物为清洁级Wistar大鼠，雄性，鼠龄8
        依据。                                                周，体质量为 190～220 g，购自北京维通利华实验动物
        1 材料                                               技术有限公司，动物生产许可证号为 SCXK（京）2016-
        1.1  主要仪器                                          0006，动物使用许可证为SYXK（蒙）2015-0001。大鼠均
            本研究所用主要仪器有 JP-1000B-8W 型药物粉碎                   饲养于内蒙古医科大学实验动物中心清洁区，室温为
        机（永康市久品工贸有限公司），CT15RE 型高速离心机                       18～22 ℃。
       （日本Hitachi公司），DYY-6C型电泳槽、DYY-6C型电泳                  1.4  细胞
        仪（北京六一生物科技有限公司），7500 Fast型荧光定量                         大鼠HSC-T6细胞购自北京北纳科技有限公司。
        聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Thermo Fisher Scientific           2 方法
        公司），SM2010R型切片机（德国Leica公司）。                        2.1 细胞实验研究
        1.2 主要药品与试剂                                        2.1.1  额力根-7含药血清的制备            除人工牛黄外，将额
            本 研 究 所 用 蓝 盆 花（批 号 171219）、红 花（批 号            力根-7处方中其余药材均粉碎，过100目筛，然后取红花
        171103）、瞿麦（批号 170910）、香青兰（批号 171109）、五             180 g、香青兰60 g、蓝盆花60 g、瞿麦60 g、石膏180 g、五
        灵脂（批号171215）、人工牛黄（批号171030）、石膏（批号                  灵脂 60 g（均为药材粉末）和人工牛黄 80 g 混合均匀后
        171217）等药材均购自内蒙古天盛蒙中医有限责任公                         得到额力根-7（临用时以 0.5％羧甲基纤维素钠溶液溶
        司，由内蒙古医科大学蒙医药学院蒙药炮制实验中心                            解）。将大鼠随机分为对照组和给药组（1.35 g/kg 额力
        呼日乐巴根副教授鉴定为真品。重组人 TGF-β（美国                         根-7，剂量为临床等效剂量的10倍），每组8只。对照组
        Peprotech 公 司 ，批 号 0918AF35451419）；胰 酶（美 国         大鼠灌胃等量羧甲基纤维素钠溶液，给药组大鼠灌胃相
        Proemga 公司，批号 121652）；FastKing cDNA 第一链合           应药物，每天1次，连续8 d。第8天时，给药组大鼠于腹


        中国药房    2021年第32卷第23期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23  ·2833 ·
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