Page 24 - 《中国药房》2021年23期
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主动脉取血适量，血样静置 20 min 后，以 3 000 r/min 离 细胞，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2～3次，加入适量RI-
心 15 min；取上清液，以 0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得含 PA 裂解液提取总蛋白，并置于冰上充分裂解 20 min 后
药血清 [6－7] 。对照组同法操作，制备空白血清。 于 4 ℃条件下以 13 000 r/min离心15 min；取上清液，采
2.1.2 细胞分组、造模与给药 将 HSC-T6 细胞复苏种 用BCA法测定蛋白浓度。蛋白经煮沸变性后，进行十二
板后置于37 ℃、5％ CO2的条件下（以下培养条件相同） 烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）；转
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培养12 h，然后调整细胞密度为6×10 mL ，分为模型组 膜，以 5％脱脂奶粉封闭 1 h；加入 GAPDH（稀释度为 1 ∶
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和额力根-7 含药血清低、中、高剂量组，每组设 3 个复 20 000）、α-SMA（稀释度为1∶2 500）、CollagenⅠ（稀释度
孔。各组细胞先加入0.2 mg/mL TGF-β溶液10 μL，培养 为1 ∶ 1 000）、PI3K（稀释度为1 ∶ 1 000）、Akt（稀释度为1 ∶
48 h以复制肝纤维化模型 ；然后弃培养基，模型组加入 1 000）、PTEN（稀释度为 1 ∶ 1 000）一抗，于 4 ℃孵育过
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10％空白血清，额力根-7 含药血清各剂量组分别加入 夜；以TBST清洗10 min×3次，加入荧光标记二抗（稀释度
10％、15％、20％含药血清（剂量根据课题组前期预实验 为1∶10 000）常温孵育1 h；以TBST清洗10 min×3次，采
结果设置）。 用近红外激光成像系统成像。采用Image Studio软件进
2.1.3 细胞增殖抑制率的检测 采用 MTT 法进行检 行分析，以目的蛋白与内参 GAPDH 的灰度值比值表示
测。取 HSC-T6 细胞，调整细胞密度为 6×10 mL ，按
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目的蛋白的表达水平。
“2.1.2”项下方法分组、造模与给药（同时设不加细胞的
2.2 动物实验研究
空白对照组），分别培养 24、48、72 h 后，按 MTT 试剂盒
2.2.1 造模、分组与给药 将Wistar大鼠随机分为空白
说明书方法测定各孔吸光度（OD）值，并计算HSC-T6细
组、模型组和额力根-7 低、中、高剂量组（135、270、405
胞的增殖抑制率[增殖抑制率＝（模型组平均OD值－实
mg/kg，剂量分别为临床等效剂量的 1、2、3 倍），每组 10
验组平均OD值）/（模型组平均OD值－空白对照组平均
只。除空白组外，其余 4 组大鼠参考文献[11－12]灌胃
OD值）×100％]。
CCl4 （2 mL/kg）以复制肝纤维化模型，每周 2 次，连续 10
2.1.4 细胞凋亡率的检测 采用流式细胞仪进行检
周。造模的同时，空白组和模型组大鼠灌胃 0.5％羧甲
测。取 HSC-T6 细胞，调整细胞密度为 6×10 mL ，按
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基纤维素钠溶液，其余各组大鼠均灌胃相应药物，每天1
“2.1.2”项下方法分组、造模与给药，培养 24 h。收集细
次，连续10周。
胞，按 Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡试剂盒说明书方法操
2.2.2 大鼠肝组织病理形态学的观察 末次灌胃结束
作后，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。
后，处死各组大鼠，取其肝组织，一部分置于 4％甲醛溶
2.1.5 细胞周期的检测 采用流式细胞仪进行检测。
液中固定，一部分于－80 ℃下保存，备用。将固定 48 h
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取HSC-T6细胞，调整细胞密度为6×10 mL ，按“2.1.2”
的肝组织进行乙醇梯度脱水，再以二甲苯透明替换、浸
项下方法分组、造模与给药，培养24 h。收集细胞，按细
蜡、包埋、切片（厚度约 5 μm）后，分别进行苏木精-伊红
胞周期与细胞凋亡检测试剂盒说明书方法操作后，采用
（HE）染色和 Masson 染色，然后于光学显微镜下观察肝
流式细胞仪检测各组细胞的周期分布。
组织病理形态变化。
2.1.6 细胞中CollagenⅠ、α-SMA和PI3K/Akt信号通路
2.2.3 大鼠肝组织中CollagenⅠ、α-SMA和PI3K/Akt信
相关因子 mRNA 表达水平的检测 采用 q-PCR 法进行
检测。取HSC-T6细胞，调整细胞密度为6×10 mL ，按 号通路相关因子 mRNA 表达水平的检测 取“2.2.2”项
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“2.1.2”项下方法分组、造模与给药，培养 24 h。收集细 下冻存的各组大鼠肝组织，同“2.1.6”项下“采用 TRIzol
胞，采用 TRIzol 法提取总 RNA，然后根据试剂盒说明书 法提取总 RNA……PTEN mRNA 的表达水平”操作，检
相关方法，将总 RNA 逆转录为 cDNA。以 cDNA 为模 测肝组织中CollagenⅠ、α-SMA和PI3K/Akt信号通路相
板，进行 PCR 扩增。反应体系为：cDNA 模板 2 μL，2× 关因子mRNA的表达水平。
SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 2.2.4 大鼠肝组织中 CollagenⅠ、α-SMA 蛋白和 PI3K/
0.4 μL，上、下游引物各 0.6 μL，RNase-free ddH2O 6.4 Akt信号通路相关蛋白表达水平的检测 取“2.2.2”项下
μL。反应条件为：95 ℃预变性 15 min；95 ℃变性 10 s， 冻存的各组大鼠肝组织，同“2.1.7”项下“以PBS洗涤2～
60 ℃退火 30 s，共 40 个循环。以β-actin 为内参，采用 3次……表示目的蛋白的表达水平”操作，检测肝组织中
2 －ΔΔCt 法计算CollagenⅠ、α-SMA、PI3K、Akt、PTEN mRNA CollagenⅠ、α-SMA 蛋白和 PI3K/Akt 信号通路相关蛋白
的表达水平。 的表达水平。
2.1.7 细胞中CollagenⅠ、α-SMA蛋白和PI3K/Akt信号 2.3 统计学方法
通路相关蛋白表达水平的检测 采用 Western blot 法进 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。数据以
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行检测。取HSC-T6细胞，调整细胞密度为6×10 mL ， x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
按“2.1.2”项下方法分组、造模与给药，培养 24 h。收集 比较采用LSD检验。检验水准α＝0.05。
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