Page 68 - 《中国药房》2021年22期
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精染色剂（批号 YJ0058）均购自广州永津生物科技有限                        小鼠脑组织切片，用二甲苯脱蜡，对抗原进行修复、封闭
        公司；ECL 显色液（批号 CW0049S）购自康为世纪生物                      后，加入LC3一抗（稀释比例为1 ∶ 100），于4 ℃下孵育过
        科 技 有 限 公 司 ；PrimeScript  TM  RT Master Mix（Perfect  夜；用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）洗涤5 min×5次，加入
        Real Time）预混液（批号 RR047A）、SYBR Premix Ex             HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗，于 37 ℃下孵育 20 min；
                                              ®
        Taq （Tli RNaseH Plus）试剂盒（批号RR820A）均购自日              用 PBS 洗涤 5 min×5 次，以 DAB 显色剂显色，用 PBS 终
           TM
        本Takara公司；兔源β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（批                  止反应，并以苏木精复染，经乙醇梯度洗脱、二甲苯透明
        号bs-0061R）、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（供Western                 后，用中性树胶封片。使用成像系统成像，并于正置光
        blot用，批号bs-40295G-HRP）均购自北京博奥森生物技                   学显微镜下观察各组小鼠神经元内LC3的阳性分布（阳
        术有限公司；兔源LC3多克隆抗体（批号ab48394)、兔源                      性显棕黄色），使用 Image J v1.8.0 软件计算其积分光密
        p62 多克隆抗体（批号 ab109012)、兔源 PINK1 多克隆抗                度（IOD）。
        体（批 号 ab23707）、兔 源 Parkin 多 克 隆 抗 体（批 号             2.4  小 鼠 脑 组 织 线 粒 体 中 LC3、p62、Cathepsin D、
        ab15954）均购自英国Abcam公司；其余试剂均为分析纯                      Rab7、PINK1、Parkin mRNA表达的检测
        或实验室常用规格，水为超纯水。                                         采用实时荧光定量PCR法进行检测。取“2.2”项下
        1.3 实验动物                                            冻 存 的 各 组 小 鼠 脑 组 织 线 粒 体（Cathepsin D、Rab7
            本研究所用实验动物为 SPF 级雄性 B6C3-Tg（AP-                  mRNA 的检测不考虑 TEN 中剂量+3-MA 组），经 PMSF
        PswePSEN1dE9）/Nju 系 APP/PS1 双转基因小鼠（简称               裂解后，用 Trizol 试剂提取总 RNA，取样品 2 μL 测定
       “APP/PS1小鼠”）50只和SPF级雄性同系野生型小鼠10                      RNA 浓 度 ，按 照 PrimeScript TM  RT Master Mix（Perfect
        只，3～4月龄，均购自南京大学模式动物研究所，动物生                          Real Time）预混液说明书方法进行 cDNA 反转录，取
                                                                                        TM
                                                                           ®
        产许可证号为 SCXK（苏）2015-0001。所有小鼠均饲养                     cDNA 按照SYBR Premix Ex Taq （Tli RNaseH Plus）试
        于广东药科大学实验动物中心SPF级动物房（温度22～                          剂盒说明书方法进行PCR。反应体系（10 μL）如下：2×
        26 ℃，相对湿度 40％～70％，光照/黑暗时间 12 h/12 h）                Ultra SYBR Mixture 5 μL，上、下游引物各 0.2 μL，cDNA
        中，自由进食、饮水。本研究相关实验操作均严格遵守                            模板 1 μL，ddH2O 3.6 μL。扩增条件如下：95 ℃预变性
        广东药科大学《实验动物伦理委员会章程》的相关规定。                           10 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 32 s，
        2 方法                                                共40个循环。每组设3个复孔，采用2              －ΔΔCt 法以GraphPad
        2.1  分组与给药                                          Prism 8.0 软件进行分析，以β-actin 为内参，计算目标基
            将50只APP/PS1小鼠随机分为模型组，TEN低、中、                    因的表达量，并以正常对照组为参照进行归一化处理。
        高剂量组[20、40、80 mg/（kg·d），剂量均按本课题组前期研                 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成，
        究结果设置]，TEN中剂量+3-MA组[TEN 40 mg/（kg·d）+               引物序列和产物片段长度见表1。
        3-MA 30 mg/（kg·d），剂量均按本课题组前期研究结果                        表1    LC3等基因的引物序列和产物片段长度
        设置]，每组10只。另将10只同系野生型小鼠作为正常                          Tab 1 Primer sequence and product fragment length
        对照组。各给药组小鼠灌胃相应剂量的药液[溶剂均为                                   of LC3 and other genes
        0.3％羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液]，模型组和正常                        基因                 引物序列（5′→3′）       产物片段长度，bp
                                                             LC3          上游：TCGCTGACATCTATGAACAGG    88
        对照组小鼠灌胃 0.3％CMC-Na 溶液，每天给药 1 次，给
                                                                          下游：TTGACTCAGAAGCCGAAGG
        药体积为0.01 mL/g，连续给药3个月后进行后续实验。                        p62          上游：TGAGGAAGATCGCCTTGGA      155
        2.2 取样方法                                                          下游：TTCGGATTCTGGCATCTGTAG
                                                             Cathepsin D  上游：AGCTGTCCTACCTGAACGTC     160
            小鼠末次给药后禁食 12 h，脱颈椎处死，快速于冰                                     下游：AGCTCCTTCACCTCTTCCAC
        上分离脑组织并置于－80 ℃冰箱中保存，备用。每组随                           Rab7         上游：GACAGCTGGAGAGACGAGTT     216
                                                                          下游：CCGAGCAATTGTCTGGAAGG
        意选取 3 只小鼠的脑组织适量，用 4％多聚甲醛溶液固
                                                             PINK1        上游：CATGGCTTTGGATGGAGAGT     266
        定24 h，对脑组织进行脱水处理、经石蜡包埋后切片（厚                                       下游：TGGGAGTTTGCTCTTCAAGG
        度约 4 μm），用于免疫组化染色。按照组织线粒体分离                          Parkin       上游：CTTCCCAGTGGAGGTCG        487
                                                                          下游：GAGGGTTGCTTGTTTGC
        试剂盒说明书方法操作，分离提取每组剩余7只小鼠脑                             β-actin      上游：CATGTACGTTGCTATCCAGGC    250
        组织的线粒体并置于－80 ℃冰箱中保存，用于相关                                          下游：CTCCTTAATGTCACGCACGAT
        mRNA和蛋白检测。                                          2.5  小鼠脑组织线粒体中 LC3、p62、PINK1、Parkin 蛋
        2.3  小鼠神经元内LC3阳性分布的检测                               白表达的检测
            采用免疫组化染色法进行检测。取“2.2”项下各组                            采用Western blot法进行检测。取“2.2”项下冻存的


        ·2750 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 22                                 中国药房    2021年第32卷第22期
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