Page 67 - 《中国药房》2021年22期
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significantly）and Parkin（except for TEN low-dose group decreased significantly）were increased significantly in TEN low-dose，
        medium-dose and high-dose groups（P＜0.05 or P＜0.01）；mRNA（except for TEN low-dose group）and protein expressions of
        p62 were decreased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）. Compared with TEN medium-dose group，the changes of above indexes
        were inhibited significantly in TEN medium-dose + 3-MA group （P＜0.05 or P＜0.01）. CONCLUSIONS：TEN can induce
        mitophagy in brain tissue of AD model mice by activating PINK1/Parkin signaling pathway and improve lysosome function.
        KEYWORDS     Tenuifolin；Alzheimer’s disease；PINK1/Parkin signaling pathway；Mitochondrial autophagy；APP/PS1 double
        transgenic mice

            阿尔茨海默病（AD）是一种主发于老年人的慢性中                        （tenuifolin，TEN）是远志总皂苷经碱水解减毒后的主要
        枢神经系统退行性疾病，其主要病理特征包括：神经元                           次级皂苷成分，相较于远志皂苷元，TEN的性质更稳定，
        外以β淀粉样蛋白（Aβ）沉积为核心而形成的老年斑，细                         且溶血等毒副作用大大降低 。有研究表明，远志的皂
                                                                                    [15]
        胞内以超磷酸化的Tau为核心而形成的神经原纤维缠结                          苷类化合物可增加正常小鼠脑神经元自噬标志物微管
        以及神经元丢失等        [1－3] 。已有研究表明，神经元内自噬               相关蛋白1轻链3（LC3）的表达，减少自噬选择性底物泛
        途径受损会阻碍受损线粒体的清除，受损线粒体累积会                           素结合蛋白 p62 的表达，提高小鼠的学习与记忆能
                                                              [16]
        导致 Tau 蛋白聚集，而聚集的 Tau 蛋白又会进一步加重                     力 。 远 志 可 通 过 激 活 腺 苷 一 磷 酸 活 化 蛋 白 激 酶
        线粒体自噬障碍，导致腺苷三磷酸生成受阻，最终引起                           （AMPK）/mTOR信号通路来诱导线粒体自噬，从而减少
                        [4]
        脑内神经元的死亡 。此外，Aβ聚集多发生在神经元外                          SH-SY5Y 细胞中 Aβ蛋白的分泌，进而发挥抗 AD 的作
        部，亦可进入细胞内，并能在线粒体内沉积，从而损伤线                          用 [17－18] 。本研究拟通过动物实验，基于 PINK1/Parkin 信
        粒体的形态结构和功能，诱发细胞凋亡，反之线粒体形                           号通路研究 TEN 对 AD 模型小鼠脑组织线粒体自噬的
        态结构、功能异常也可进一步加剧Aβ聚集 。自噬诱导                          影响，旨在为深入研究TEN的抗AD机制提供参考。
                                            [5]
        剂雷帕霉素可通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白                              1 材料
       （mTOR）而诱导和促进线粒体自噬，减少Aβ和Tau蛋白                        1.1  主要仪器
                       [6]
        聚集，保护神经元 。由此可见，AD 的发生和发展可能                             本研究所用主要仪器包括CFX Connect型荧光定量
        与线粒体自噬障碍密切相关。                                      聚合酶链反应（PCR）仪（美国 Bio-Rad 公司），Eclipse
            线粒体自噬是指以线粒体为靶细胞器的自噬过程，                         E100 型正置光学显微镜、DS-U3 型成像系统（日本
        是通过自噬体与自噬启动蛋白等相关因子共同作用来                            Nikon 公司），H1650-W 型台式微量高速离心机（长沙湘
        清除受损线粒体以维持生物体内线粒体的稳态，在维持                           仪离心机仪器有限公司），GeneGnome XRQ型凝胶成像
        细胞正常生命活动中起着重要的作用，被认为是保护神                           仪（英国Syngene公司），NanoDrop Lite型超微量分光光
        经元的关键要素       [7－9] 。在哺乳动物中，参与线粒体自噬                度计（美国Thermo Scientific公司）等。
        的主要信号通路有人第 10 号染色体缺失的磷酸酶及张                         1.2  主要药品与试剂
        力蛋白同源基因诱导的假定激酶 1（PINK1）/E3 泛素连                         TEN对照品（货号A1023AS，纯度＞98％）购自大连
        接 酶（Parkin）蛋 白 信 号 通 路 、FUN14 结 构 域 蛋 白 1          美仑生物技术有限公司；自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤
       （FUNDC1）信号通路、B 细胞淋巴瘤 2/腺病毒 E1B 相互                   （3-MA）对照品（货号 S2767，纯度 99.97％）购自美国
        作用蛋白 3（BNIP3）/NIP3 样蛋白 X（NIX）信号通路等，                Selleck Chemicals 公司；组织线粒体分离试剂盒（批号
        其中神经系统线粒体自噬主要受 PINK1/Parkin 信号通                    C3606）、苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解液（批号ST505）、二
        路的影响，应激诱导的线粒体自噬被触发后会通过                             喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析试剂盒（批号P0010S）、十
        PINK1/Parkin 信号通路介导的相关途径来消除受损的                     二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂
                                          [10]
        线粒体，从而维持细胞的正常生命活动 。Lutz 等 的                        盒（批号 P0012A）均购自上海碧云天生物技术有限公
                                                    [11]
        研究结果表明，在Parkin或PINK1缺失的人神经母细胞                      司；Trizol试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；通用型
        瘤SH-SY5Y细胞中，线粒体动力相关蛋白1的表达量增                        显 色 试 剂 盒（小 鼠/兔 聚 合 物 法 检 测 系 统）（批 号
        加，代表线粒体分裂增加，而 Parkin 和 PINK1 可能有调                  PV-6000）、二 氨 基 联 苯 胺（DAB）显 色 剂（ 批 号
        节线粒体分裂的作用。                                         ZLI-9019）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免
            远志 Polygalae Radix 为远志科植物远志（又名细叶               疫球蛋白G（IgG）二抗（供免疫组化用，批号PV-9000）均
        远志）Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志（又名宽叶远           购自北京中杉金桥生物技术有限公司；柠檬酸钠抗原修
        志）Polygala sibirica L.的干燥根，主要药用成分为远志               复液（批号YJ0023）、内源性过氧化氢酶阻滞剂3％双氧
        皂苷，具有中枢神经系统保护作用              [12－14] 。细叶远志皂苷       水（批号YJ0036）、免疫组化封闭液（批号YJ0054）、苏木


        中国药房    2021年第32卷第22期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 22  ·2749 ·
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