Page 66 - 《中国药房》2021年21期
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燥块根，具有抗衰老、降血脂、抗癌、抗炎、促进免疫调                           国食品药品检定研究院；其余试剂为实验室常用规格，
                          [2]
        节、保护神经等作用 ；但也有相关研究发现，何首乌提                           水为纯化水。
                                           [3]
        取物可能导致肝毒性、肾毒性和胚胎毒性 。                                1.3 细胞
            研究发现，何首乌的主要成分有二苯乙烯苷、蒽醌                              人正常肝细胞 L02 购自中国科学院典型培养物保
        类（包括大黄素、大黄酸、大黄素甲醚等）、鞣质（包括没                          藏委员会细胞库。
        食子酸等）和磷脂等，其中大黄素可通过刺激活性氧簇                            2 方法
        （ROS）的释放，启动外源性和内源性细胞凋亡途径来诱                          2.1 何首乌主要成分的毒性预测
        导HepaRG细胞凋亡       [4－5] ；二苯乙烯苷、大黄素甲醚、大黄                 参考文献[8－9]的方法，采用 ADMETlab 2.0 平台
        素-8-O-β-D-葡萄糖苷、顺式二苯乙烯苷、儿茶素等 5 种                    （https：//admet.scbdd.com/）进行预测。首先，将何首乌的
        成分与何首乌的毒性具有较强的相关性 ，但具体作用                            5种主要成分大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、二苯乙烯苷、
                                           [5]
        机制尚不明确。                                             没食子酸的化学结构式输入该平台，得出各成分的
            探讨药物对代谢酶的影响是药物肝毒性研究的重                           SMILE 表达式；然后预测各成分对肝、皮肤、心脏、呼吸
        要组成部分。研究发现，药物在人体内的代谢途径可分                            系统、芳烃受体的毒性作用及致癌作用，并评估这些成
        为Ⅰ相代谢途径和Ⅱ相代谢途径，其中Ⅰ相代谢途径主                            分对 CYP450 酶系（包括 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、
        要是氧化和羟基化，Ⅱ相代谢途径主要是硫酸酯化和葡                            CYP2D6、CYP3A4）的抑制作用。当评估预测值为0～＜
                   [6]
        萄糖醛酸化 。细胞色素 P450 （CYP450 ）酶系是Ⅰ相代谢                   0.3 时，提示成分的毒性/致癌/抑制作用弱；当该预测值
        途径中的主要酶系，可影响多种药物代谢；葡萄糖醛酸                            为 0.3～＜0.7 时，提示成分的毒性/致癌/抑制作用为中
        转移酶（UGTs）是Ⅱ相代谢途径中的主要酶系，对胆红                          等；当该预测值为0.7～1.0 时，提示成分的毒性/致癌/抑
        素和多种药物的代谢具有重要作用                [6－7] 。其中胆红素经        制作用较强。
        血液循环至肝脏后，可通过 UGTs 形成胆红素葡萄糖醛                         2.2  何首乌主要成分对L02细胞活性的影响考察
        酸化合物，进一步被排泄至胆囊及肠道进行清除；葡萄                            2.2.1  细胞培养      将 L02 细胞以含 10％胎牛血清的
        糖醛酸转移酶 1 家族多肽 A1（UGT1A1）为该过程的限                      DMEM培养基在37 ℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。待
        速酶，当其受到抑制时，可导致胆红素的清除减慢，从而                           细胞融合度达 70％～80％时，以胰酶消化传代，进行后
                                         [7]
        表现出肝内胆汁淤积，进而损伤肝细胞 。                                 续实验。
            基于此，笔者首先采用 ADMETlab 2.0 平台预测何                   2.2.2  细胞存活率的检测及形态学观察                取对数生长
        首乌主要成分（大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、二苯乙烯                           期的 L02 细胞，按 5×10 个/孔接种于 96 孔板中，然后分
                                                                                3
        苷、没食子酸）对肝、皮肤、心脏的毒性或致癌作用，并评                          为大黄素不同浓度组（10、20、40、80 μmol/L，浓度参考文
        估这些成分对细胞色素 P450酶系的影响；采用人正常肝                         献[10]进行设置，下同）、大黄酸组不同浓度组（10、20、
        细胞L02验证何首乌主要成分的肝毒性，进而在体外反                           40、80 μmol/L）、二苯乙烯苷不同浓度组（10、20、40、80
        应体系层面研究何首乌主要成分对 UGT1A1 酶活性的                         μmol/L）、没食子酸不同浓度组（10、20、40、80 μmol/L），
        影响，以期从代谢角度阐明何首乌肝毒性的作用机制。                            另设不加药物只加细胞的空白组，每组设5个复孔（大黄
        1 材料                                                素甲醚与大黄素结构类似，故本实验不设置大黄素甲醚
        1.1  主要仪器                                           组）。待细胞贴壁后，各组细胞加入相应药物培养24 h，
            本研究所用主要仪器有 Multiskan SkyHigh 型全波                再加入 CCK-8 试剂 10 μL 培养 1 h，然后采用酶标仪于
        长酶标仪、17R 型高速低温离心机（美国 Thermo Fisher                  450 nm 波长下检测各孔的光密度值（OD），计算细胞存
        Scientific 公司），AE240 型电子天平（德国 Sartorius 公           活 率 [ 细 胞 存 活 率 ＝（OD 空 白 组 － OD 实 验 组）/OD 空 白 组 ×
        司），DK 600 型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限                        100％]。细胞存活率检测结束后，取各组细胞适量分别
        公司），F8型超细匀浆机（德国 Fluko公司）。                           于显微镜下观察形态，并以大黄素不同浓度组细胞为代
        1.2 主要药品与试剂                                         表拍照保存（其余组别的细胞显微图略）。
            本研究所用大黄素（批号E7881）购自美国Sigma公                     2.3 何首乌主要成分对UGT1A1酶活性的影响
        司；大黄酸、二苯乙烯苷、没食子酸（批号分别为201812、                       2.3.1 UGT1A1酶抑制率的测定           参考文献[11－12]方
        201903、201909）均购自成都曼思特生物科技有限公司；                     法并进行改进，制备尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）-
        RPMI1640 培养基、胎牛血清（批号分别为 31800022、                   缓冲系统，然后分为大黄素不同浓度组（5、10、20、40、80
        10100147）均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒（批号                   μmol/L，浓度根据预实验结果设置，下同）、大黄酸不同
        C0038）购自上海碧云天生物技术有限公司；HLA-                          浓度组（5、10、20、40、80 μmol/L）、没食子酸不同浓度组
        UGT1A1 酶（批号 456411）购自美国 Gentest 公司；胆红              （5、10、20、40、80 μmol/L）以及空白组（加酶但不加药
        素测定试剂盒（批号ab235627）购自英国Abcam公司；胆                     物），每组设5个复孔。各组均以胆红素（0.2 μg/μL）为反
        红素对照品（批号 100077-201806，含量 99.3％）购自中                 应底物，加入 UGT1A1 酶（0.5 U/L）1 μL 以及相应药物，


        ·2620 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 21                                 中国药房    2021年第32卷第21期
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