Page 67 - 《中国药房》2021年21期

置于 37 ℃恒温水浴条件下避光反应 10 min 后，加入冰 对CYP2D6、CYP3A4的抑制作用较弱；二苯乙烯苷和没
乙腈-甲醇溶液600 μL终止反应；然后将反应液以15 000 食子酸对 CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4 的抑制
r/min离心 25 min，取上清液175 μL加入96孔板中，并根 作用均较弱；各成分对CYP2C19的抑制作用均较弱，详
据胆红素测定试剂盒说明书方法进行操作，采用酶标仪 见表2。
于550 nm波长处测定各孔OD值，并计算酶抑制率[酶抑 表 2 何首乌主要成分对细胞色素 P450酶系的抑制作用
制率＝（OD 空白组－OD 实验组 ）/OD 空白组×100％]。 预测结果
2.3.2 大黄素对 UGT1A1 酶动力学的影响考察 以胆 Tab 2 Prediction results of inhibitory effect of main
红素系列溶液（0.125～2 mmol/L）为底物，参考“2.3.1” components of P. multiflorum on cytochrome
项下方法，测定不同浓度大黄素[0（作为空白对照）、20、 P450 enzyme system
40、80 μ mol/L] 对 UGT1A1 酶 的 抑 制 率 ，采 用 Line- 细胞色素P450酶系
主要成分
weave-Burk 双倒数作图法确定大黄素对 UGT1A1 酶的 CYP1A2 CYP2C19 CYP2C9 CYP2D6 CYP3A4
大黄素 0.950 0.103 0.575 0.378 0.651
[13]
反应类型 。 大黄素甲醚 0.947 0.208 0.597 0.343 0.624
2.3.3 大黄素对 UGT1A1 酶抑制的可逆性考察 参考 大黄酸 0.371 0.033 0.481 0.114 0.126
文献[14]方法，取 UGT1A1 酶溶液（1 U/mL）0.5 mL 与 二苯乙烯苷 0.077 0.017 0.002 0.015 0.027
没食子酸 0.023 0.026 0.188 0.008 0.034
1 mg 大黄素混合，于 37 ℃恒温水浴条件下预处理 1 h，
3.2 何首乌主要成分对L02细胞存活率的影响
再置于4 ℃的 0. 1 mol /L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中透析
与空白组比较，大黄素40、80 μmol/L组和没食子酸
24 h，透析期间每 8 h 更换 1 次磷酸盐缓冲液，作为大黄
40、80 μmol/L组细胞存活率均显著降低（P＜0.01），且具
素透析组；同时，设置只加酶不加大黄素的空白透析
有一定浓度依赖趋势；大黄酸不同浓度组和二苯乙烯苷
组。另取UGT1A1酶溶液（1 U/mL）0.5 mL与1 mg大黄
不同浓度组细胞存活率差异无统计学意义，详见表 3。
素混合，不进行透析，直接置于 4 ℃条件下保存 24 h 作
细胞形态观察结果显示，空白组细胞形态正常；大黄素
为大黄素非透析组；同时，设定只加酶不加大黄素的空
不同浓度组细胞随给药浓度的增加，表现出明显的色质
白非透析组。每组设5个平行。透析（或非透析放置）结
凝集、核浓缩、核裂解等，且伴随发泡、凋亡小体生成，详
束后，将混合溶液分别稀释 10、50、100、500、1 000 倍， 见图1。
测定 OD 值，并计算酶相对活性[酶相对活性＝OD 实验组/
表3 各组细胞存活率的测定结果（x±±s，n＝5，％％）
OD 空白组×100％，式中透析或非透析实验组分别对应相应
Tab 3 Determination results of survival rate of cells
的透析或非透析空白组]。
in each group（x±±s，n＝5，％％）
2.4 统计学方法
组别 细胞存活率 组别 细胞存活率
采用 SPSS 21.0 统计软件进行分析。计量资料以 空白组 102.9±12.4 二苯乙烯苷10 μmol/L组 109.1±16.4
x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准 大黄素10 μmol/L组 93.7±7.5 二苯乙烯苷20 μmol/L组 128.4±17.0
α＝0.05。 大黄素20 μmol/L组 89.1±5.3 二苯乙烯苷40 μmol/L组 106.1±10.0
大黄素40 μmol/L组 59.4±11.3 ＊＊ 二苯乙烯苷80 μmol/L组 102.1±13.4
3 结果
大黄素80 μmol/L组 29.5±5.0 ＊＊ 没食子酸10 μmol/L组 77.6±5.3
3.1 何首乌主要成分的毒性预测结果 大黄酸10 μmol/L组 92.9±6.1 没食子酸20 μmol/L组 75.6±9.8
3.1.1 毒性及致癌作用预测结果 何首乌中的大黄素、 大黄酸20 μmol/L组 90.1±2.8 没食子酸40 μmol/L组 66.8±8.3 ＊＊
大黄酸40 μmol/L组 83.9±7.1 没食子酸80 μmol/L组 38.6±3.2 ＊＊
大黄素甲醚、大黄酸对肝、芳烃受体的毒性作用较强，二
大黄酸80 μmol/L组 72.4±7.3
苯乙烯苷对皮肤、芳烃受体的毒性作用较强；没食子酸
＊＊
注：与空白组比较， P＜0.01
对肝、皮肤的毒性作用较强，详见表1。 Note：vs. blank group， P＜0.01
＊＊
表1 何首乌主要成分的毒性及致癌作用预测结果 3.3 何首乌主要成分对UGT1A1酶活性的影响
Tab 1 Prediction results of hepatotoxicity and carci- 3.3.1 UGT1A1酶抑制率 大黄素和没食子酸不同浓度
nogenic effects of main components of P. multi- 组（大黄素 5 μmol/L 组除外）的 UGT1A1 酶抑制率较空
florum 白组均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），大黄酸不同浓度组
主要成分 肝 皮肤 心脏 呼吸系统 芳烃受体 致癌作用 的UGT1A1酶抑制率较空白组无统计学意义，详见表4。
大黄素 0.935 0.678 0.039 0.076 0.977 0.301 3.3.2 UGT1A1 的酶动力学 大黄素对 UGT1A1 酶的
大黄素甲醚 0.935 0.258 0.040 0.123 0.966 0.536 抑制作用与给药浓度成正比，酶催化反应的最大反应速
大黄酸 0.989 0.534 0.028 0.069 0.917 0.620
二苯乙烯苷 0.071 0.819 0.111 0.056 0.877 0.271 率（Vmax ）以及米氏常数（Km ）随给药浓度的升高而降低，
没食子酸 0.852 0.871 0.017 0.381 0.581 0.024 表明大黄素对 UGT1A1 酶的抑制作用类型可能为竞争
3.1.2 酶抑制作用 大黄素、大黄素甲醚对CYP1A2的 性抑制，详见图2。
抑制作用较强，对CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的抑制作 3.3.3 UGT1A1酶抑制的可逆性 与空白透析组比较，
用中等；大黄酸对 CYP1A2、CYP2C9 的抑制作用中等， 空白非透析组的 UGT1A1 酶相对活性差异无统计学意

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