Page 34 - 《中国药房》2021年21期
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肝纤维化的治疗是阻断肝疾病恶化的关键环节。 肝纤                            木 精 - 伊 红（HE）染 色 液（批 号 分 别 为 20160320、
        维化的病理机制复杂，目前仍缺乏有效的靶向药物进行                            20160101、20160225、20160218、D006）均购自南京建成
        治疗。中医药具有多靶点、多途径、多层次的治疗优势，                           生物工程研究所；兔源 Akt 多克隆抗体、兔源 AMPK 多
        如中药复方制剂复方鳖甲软肝片、扶正化瘀胶囊等已广                            克隆抗体、兔源mTOR多克隆抗体、兔源P70S6K多克隆
                                                 [3]
        泛用于肝纤维化的治疗，且具有较好的临床疗效 。                             抗体、兔源 Beclin-1 多克隆抗体、兔源 LC3-Ⅱ多克隆抗
            扶脾柔肝颗粒（FRG）是由贵州中医药大学第一附                         体、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体、辣
        属医院开发的院内制剂，由黄芪、白术、苡仁、丹参等9味                          根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G抗体（二抗）、
        药物组成，具有健脾柔肝、补气活血的功效，主要用于治                           BCA蛋白测定试剂盒（批号分别为E1A6261、E1A6422、
        疗肝纤维化、肝硬化等          [4－5] ，其临床疗效较好，具有推广             E1A6308、E18-6226、E90562、E1A4007、E1C604-1、
        和开发为上市新药的价值。                                        E1WP318、E1WP201-2）均购自南京恩晶生物科技有限
            研究发现，蛋白激酶 B（Akt）/腺苷酸活化蛋白激酶                      公司；ECL 发光试剂（批号 P0018A）购自上海碧云天生
        （AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/p70 核糖                     物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国 Sigma
        体蛋白S6激酶（p70S6K）是经典的自噬信号通路                 [6－7] ，在  公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计并合
        肝纤维化的发生发展过程中具有重要作用，可参与调节                            成（PCR 引物序列与产物长度见表 1）；其余试剂为实验
        肝星状细胞的增殖活化、胶原合成、自噬和凋亡等                      [8－9] 。  室常用规格，水为纯净水。
        Beclin-1 和 LC3-Ⅱ是自噬特异性标记蛋白，可以反映自                              表1 PCR引物序列与产物长度
               [10]
        噬水平 。FRG 是否可通过上述通路发挥改善肝纤维                              Tab 1 PCR primer sequence and product length
        化的作用，尚不明确。基于此，本研究首先复制肝纤维                            基因名称                 引物                  产物长度，bp
                                                            β-actin     上游：5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′  240
        化模型大鼠，然后以 FRG 进行干预后，检测大鼠肝纤维
                                                                        下游：5′-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′
        化相关指标[层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）、Ⅲ型前                        Akt         上游：5′-ATCGTGTGGCAAGATGTGTATGA-3′  97
        胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）]水平，观察其肝组                                  下游：5′-TGAACTCCTCATCAAAATACCTGG-3′
                                                            AMPK        上游：5′-AAGGAAACAGGCAGATACCAACA-3′  166
        织的病理形态学变化，并检测其肝组织中上述几种蛋白
                                                                        下游：5′-AGAGAGGACTCGGCATCAATAAC-3′
        的表达水平，以探讨 FRG 改善肝纤维化的作用机制，以                         mTOR        上游：5′- GAGGCTGATGGACACAAATGC-3′  108
                                                                        下游：5′-TCTCCAAGTTCTACACCGTCCA-3′
        期为FRG的临床应用及新药开发提供参考。
                                                            P70S6K      上游：5′-TCTCAGTGAAAGTGCCAACCAG-3′  132
        1 材料                                                            下游：5′-CGTGGGCTACCAATAAATCTTCG-3′
        1.1  主要仪器                                           1.3  动物
            本研究所用主要仪器有：FA2004 型电子天平（上海                          本研究所用动物为SPF级SD大鼠，雌雄各半，共72
        上平仪器有限公司），D3024R 型低温高速离心机（美国                        只，体质量（160±20）g，购自南通大学实验动物中心，动
        Scilogex公司），VE 180型微型垂直电泳槽、VE 186型转                 物生产许可证号为SCXK（苏）2014-0001。
        移电泳槽、EPS 300型电泳仪（上海天能科技有限公司），                       2 方法
        TY-80B 型脱色摇床（金坛市荣华仪器制造有限公司），                        2.1  分组、造模与给药
        BSA224S型精密电子天平（德国Satorius公司），MUTIS-                     大鼠随机分为空白组、模型组、秋水仙碱片组（化学
        KAN MK3 型酶标仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公          药阳性对照，0.2 mg/kg，剂量根据临床等效剂量设置）、
        司），TL998-Ⅳ型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）                       扶正化瘀胶囊组（中药阳性对照，0.415 g/kg，剂量根据临
        仪（西安天隆科技有限公司）。                                      床等效剂量设置）和 FRG 低、中、高剂量组（20、40、80
        1.2 主要药品与试剂                                         g/kg，剂量根据临床等效剂量的 1、2、4 倍设置），空白组
            FRG由黄芪30 g、白术30 g、苡仁30 g、丹参30 g、当               和模型组各11只大鼠，其余每组10只。除空白组外，其
        归 15 g、牛膝 15 g、莪术 15 g、苍术 15 g、枳壳 15 g 组成，          余各组大鼠参照文献[11]方法进行造模，具体方法如下：
        各药材配方颗粒均购自华润三九医药股份有限公司，批                            大鼠每周腹腔注射 50％CCl4橄榄油溶液（1.5 mL/kg）2
        号 分 别 为 1504001w、1502001w、1502001s、1503002s、        次，并从造模第2周开始灌胃30％乙醇（10 mL/kg），每2
        1502002w、1502001w、1503001w、1502001w、1410001w；       天1次，共造模8周。造模结束后，从空白组和模型组中
        秋水仙碱片（国药准字 H53021904，规格 0.5 mg）购自云                  随机各抽取1只大鼠处死，然后按照《病毒性肝炎防治方
        南玉溪生物制药有限公司；扶正化瘀胶囊（国药准字                             案》中肝纤维化分期标准来判断大鼠的肝纤维化程度，
        Z20020073，规格 0.3 g）购自上海黄海制药有限责任公                    当模型组大鼠肝组织有2 期以上肝纤维化形成时，则表
                                                                                  [12]
        司；LN 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、HA ELISA                    明肝纤维化模型建立成功 。造模成功后，各给药组大
        试剂盒、PCⅢ ELISA 试剂盒、Col Ⅳ ELISA 试剂盒、苏                 鼠灌胃相应药物（临用时以水溶解），空白组和模型组大


        ·2588 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 21                                 中国药房    2021年第32卷第21期
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