Page 35 - 《中国药房》2021年21期

鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续4周。 次，加入二抗（稀释度为 1 ∶ 5 000），室温孵育 1 h；以
2.2 标本采集 TBST缓冲液冲洗5 min×3次，加入ECL显色后，置于凝
末次灌胃后，大鼠禁食 12 h，然后腹主动脉采血。 胶成像系统中成像。采用 Adobe Photoshop CS5 软件分
血样经抗凝离心后，收集上层血清，于－20 ℃保存，备 析相应蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白
用。取血完成后，处死各组大鼠，取其肝组织，部分以 GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
4％多聚甲醛固定，部分于－80 ℃保存，备用。 2.8 统计学方法
2.3 大鼠肝组织病理形态学观察 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。数据以x±s表
取“2.2”项下各组大鼠固定于 4％多聚甲醛的肝组 示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采
织，进行石蜡包埋、切片（厚度为 4 μm）。各组大鼠取 3 用LSD检验。检验水准α＝0.05。
张切片进行 HE 染色（另外 3 张切片后续进行免疫组化 3 结果
实验），然后于光学显微镜下观察大鼠肝组织的病理形 3.1 FRG 对肝纤维化模型大鼠肝组织病理形态学的
态学变化，并拍照。 影响
2.4 大鼠血清中HA、LN、PCⅢⅢ、Col ⅣⅣ水平的测定 空白组大鼠肝小叶结构正常，肝索排列整齐；模型
采用 ELISA 法进行测定。取“2.2”项下各组大鼠的 组大鼠肝小叶结构紊乱，纤维组织增生明显，部分有假
血清样品，按相应试剂盒说明书方法操作，采用酶标仪 小叶形成；药物干预组大鼠肝组织损伤均较模型组明显
于450 nm波长下测定大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Col Ⅳ 减轻，详见图1。
的水平。
2.5 大鼠肝组织中 Beclin-1 和 LC3-ⅡⅡ蛋白表达水平的
检测
采用免疫组化法进行检测。取“2.3”项下另外 3 张
切片，经脱蜡水化、组织抗原修复、山羊血清封闭后，滴
加Beclin-1、LC3-Ⅱ一抗（稀释度均为1 ∶ 100），室温孵育
2 h；以 TBST 冲洗 5 min×3 次，滴加二抗（稀释度为 1 ∶ A.空白组 B.模型组
500），室温孵育1 h；以TBST冲洗5 min×3次，经DAB显
色后，脱水封片，并于光学显微镜下观察，拍照。当切片
中出现棕黄色或棕褐色颗粒则为相应蛋白的阳性表达，
采用彩色病理图文分析系统测定阳性染色部分的平均
光密度，以表示目的蛋白的表达水平。
2.6 大 鼠 肝 组 织 中 Akt、AMPK、mTOR、p70S6K
mRNA的表达水平检测 C. FRG低剂量组 D. FRG中剂量组
采用逆转录 PCR（qRT-PCR）法进行检测。取“2.2”
项下冻存的肝组织5份，经裂解、氯仿抽提、异丙醇沉淀、
75％乙醇洗涤后，收集总 RNA；然后将 RNA 逆转录为
cDNA 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为：PCR Master-
Mix 10 μL，上下游引物各 0.6 μL，cDNA 0.4 μL，H2O
8.4 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变
性5 s，60 ℃退火30 min，共41个循环。以β-actin为内参， E. FRG高剂量组 F.秋水仙碱片组
采用2 －ΔΔCt 法计算Akt、AMPK、mTOR、p70S6K mRNA的
表达水平。
2.7 大鼠肝组织中 Akt、AMPK、mTOR、p70S6K 蛋白
表达水平的检测
采用Western blot法进行检测。取“2.2”项下冻存的
肝组织 3 份，经裂解后，提取总蛋白。采用 BCA 法测定
蛋白浓度后，对蛋白进行加热变性处理。取变性蛋白进 G.扶正化瘀胶囊组
行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以 5％ 图 1 各组大鼠肝组织病理形态学显微图（HE 染色，
BSA封闭1 h；以TBST缓冲液冲洗5 min×3次，分别加入 ×200）
Akt、AMPK、mTOR、p70S6K、GAPDH 一抗（稀释度均为 Fig 1 Micrograph of pathological changes of liver tis-
1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；以 TBST 缓冲液冲洗 5 min×3 sue of rats in each group（HE staining，×200）

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