Page 40 - 2021年19期
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培养 2 h，然后于室温下振摇 15 min 后，使用酶标仪于                     OD260 nm 与 OD280 nm 比值 1.8～2.0 为标准筛选合格样品。
        450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值。以空白对照                        取上述总 RNA 的合格样品，参照逆转录试剂盒说明书
        组为参照，计算各组的细胞存活率：细胞存活率（％）＝                           方法将其逆转录为 cDNA。以上述 cDNA 为模板，参照
        （实验组平均 OD 值－空白对照组平均 OD 值）/（正常对                      PCR 试剂盒说明书进行扩增。反应体系（共 20 µL）包
        照组平均OD值－空白对照组平均OD值）×100％。                           括：cDNA模板1 µL，SYBR Green Mix 10 µL，上、下游引
        2.7 “三色散”挥发油对FLS中NLRP3、caspase-1、ASC                物（表1）各0.4 µL，ddH2O 8.2 µL。反应条件如下：95 ℃
        蛋白表达的影响检测                                           预变性 5 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸
            采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的细                  20 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用 2          －ΔΔCt 法以
                      －1
        胞，以 1×10 mL 的密度按每孔 2 mL 接种至 6 孔板中，                  ABI 7500 v2.0.5 软件计算各目标基因 mRNA 的相对表
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        培养 24 h。吸弃培养基，将细胞随机分为空白组、模型                         达量（Ct表示每个反应管内荧光信号强度达到设定阈值
        组和“三色散”挥发油不同浓度组（10、250 μg/mL，质量                     时所经历的循环数），结果均以空白组为标准进行归一
        浓度参考“2.6”项下结果设置），每组设置 3 个复孔。取                       化处理。上述实验重复3次。
        LPS 10 mg，置于PBS 10 mL中，混匀，得1 mg/mL的LPS                        表1 PCR引物序列和产物长度
        母液；然后，取BSA 0.1 g，置于DMEM培养基50 mL中，                     Tab 1 PCR primer sequences and product length
        混匀，得 0.2％BSA 溶液；取 LPS 母液 10 mL，加至 0.2％               目标基因             引物序列（5′→3′）         产物长度，bp
        BSA 溶液 2 mL 中，混匀，得 5 μg/mL 的 LPS 工作液。模               NLRP3        上游：ACCCAAACCCACCAGTC      141
                                                                          下游：CTCCCCTCACAGCCTTC
        型组和各给药组加入 LPS 工作液 2 mL，空白组加入含                        caspase-1    上游：CAGATGCCAACCACTGAA     107
        PBS（10 µL）的0.2％BSA溶液2 mL，孵育12 h；吸弃上清                              下游：CATGATTCCCAACACAGGT
                                                             ASC          上游：CCAACAGGCAAGCAC        113
        液，空白组加入完全培养基2 mL，各药物组加入含相应
                                                                          下游：TGGTCTCTGCACGAACTG
        药物的完全培养基 2 mL，培养 24 h。吸弃培养基，各组                       GAPDH        上游：GTTGTGGCTCTGACATGCT    111
        细胞用 4 ℃的 PBS 清洗 3 次，加入 RIPA 强裂解液 100                              下游：CCCAGGATGCCCTTTAGT
        µL，于冰上裂解30 min后，在4 ℃下以12 000 r/min离心                2.9 “三色散”挥发油对FLS上清液中炎症因子水平的
        10 min，收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度后，经5×                      影响检测
        SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液稀释，于 99 ℃下变性处理                          采用ELISA法进行检测。取对数生长期的细胞，以
                                                                    －1
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        10 min。取变性蛋白 20 μg，进行 SDS-PAGE 分离后，转                1×10 mL 的密度按每孔 2 mL 接种至 48 孔板中，培养
        移至 PDVF 膜上，以 5％脱脂奶粉室温封闭 1 h；加入                      24 h。吸弃培养基，将细胞按“2.7”项下方法分组、造模、
        GAPDH、NLRP3、caspase-1、ASC 一抗（稀释度分别为                 给药。各组细胞培养 24 h 后，收集上清液，严格按相应
        1 ∶ 50 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；用  试剂盒说明书操作，以酶标仪于450 nm波长处检测各孔
        TBST 溶液清洗 10 min×3 次，加入 HRP 标记的 IgG 二抗              OD值并根据标准曲线计算IL-1β、IL-18水平。
        （稀释度为 1 ∶ 5 000），室温孵育 1 h；用 TBST 溶液清洗               2.10  统计学方法
        10 min×3 次，经 ECL 化学发光液显色后，使用超灵敏化                        采用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，使用
        学发光成像系统曝光成像。采用 Image J Version 1.53f                Graphpad 7.04软件绘图。实验数据以x±s表示，多组间
        软件分析，以目标蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带灰度                          比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验
        值的比值表示目标蛋白的相对表达量。上述实验重复                            （方差齐）或 Dunnett’s T3 检验（方差不齐）。检验水准
        3次。                                                 α＝0.05。
        2.8 “ 三 色 散 ”挥 发 油 对 FLS 中 NLRP3、caspase-1、         3 结果
        ASC mRNA表达的影响检测                                     3.1 “三色散”挥发油的提取率及GC-MS分析结果
            采用实时聚合酶链反应法（real-time PCR）进行检                       共提取得到黄色澄清且有独特芳香气味的“三色
        测。取对数生长期的细胞，以1×10 mL 的密度按每孔                         散”挥发油 0.51～0.61 g，提取率为 0.33％～0.41％（n＝
                                      5
                                          －1
        2 mL 接种至 6 孔板中，培养 24 h。吸弃培养基，将细胞                    9）。对挥发油进行GC-MS分析，其总离子流图见图1。
        按“2.7”项下方法分组、造模、给药。各组细胞培养 24 h                          本研究共分离得挥发油成分 41 种，鉴定了其中的
        后，吸弃培养基，采用RNA快速提取试剂盒提取细胞总                           30种成分，其峰面积占总峰面积的90.073 6％；相对含量
        RNA。将总RNA用焦碳酸二乙酯（DEPC）水20 µL复溶                      较高的成分依次为芳姜黄酮、δ-杜松烯、姜黄酮、姜黄新
        后取1 µL，再用DEPC水49 µL进行稀释，使用核酸蛋白                      酮、τ-杜松醇，分别占17.573 9％、15.434 5％、11.509 5％、
        检测仪分别于260、280 nm波长处检测各孔的OD值，以                       7.928 4％、7.914 4％，详见表2。


        ·2338 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 19                                 中国药房    2021年第32卷第19期
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