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剂盒（批号RN001）购自上海奕杉生物科技有限公司；逆                        均进行检测，结果以其中1份样品进行展示）。
        转录试剂盒、PCR试剂盒、ECL化学发光液（批号分别为                            称取余下的“三色散”挥发油（将上述测定后的挥发
        R222-01、Q331-02、E412-01）均购自南京诺唯赞生物科                油样品混合而得）1 g，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制
        技股份有限公司；大鼠白细胞介素 1β（IL-1β）、IL-18 酶                  成 1 g/mL（以挥发油质量计）的溶液，经 0.22 μm 微孔滤
        联 免 疫 吸 附 测 定（ELISA）试 剂 盒（批 号 分 别 为                膜滤过除菌，于 4 ℃下避光保存，作为体外细胞实验的
        JEB-13503、JEB-13733）均购自南京金益柏生物科技有                  贮备液。
        限公司；兔 NLRP3 多克隆抗体、兔胱天蛋白酶 1（cas-                    2.3 “三色散”挥发油样品的GC-MS分析条件
        pase-1）多克隆抗体、兔凋亡相关斑点样蛋白（ASC）多克                     2.3.1 GC条件      以HP-5 MS苯甲基聚硅氧烷石英毛细
        隆抗体（批号分别为ab214185、ab179515、ab127537）均购             管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）为色谱柱，采用程序升温
        自英国Abcam公司；大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）                    模式（初始温度 45 ℃，保持 2 min；以 10 ℃/min 升至
        单克隆抗体（批号 60004-1-Ig）购自美国 Proteintech 公             100 ℃ ，保 持 5 min；以 5 ℃/min 升 至 200 ℃ ，保 持 5
        司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白                         min），进样口温度为250 ℃，载气为高纯氦气，载气流速
        G（IgG）（H+L）二抗（批号S0001）购自美国Affinity公司；              为1 mL/min（恒流模式），进样量为1 μL，分流比为20∶1。
        CCK-8 试剂（批号 K1018）购自美国 APExBIO 公司；胎                2.3.2 MS 条件     电离源为电子轰击（EI）电离源，轰击
        牛 血 清 、Ⅰ 型 胶 原 酶 、蛋 白 Marker（批 号 分 别 为             能量为70 eV，离子源温度为230 ℃；扫描方式为全谱图
        10099141C、17100-017、26616）均购自美国 Gibco 公司；          扫描（full scan），扫描速度为正常速度，扫描范围为 m/z
        牛血清白蛋白（BSA，批号4240GR025）购自广州赛国生                     30～500，溶剂延迟时间为3 min。
        物科技有限公司；青霉素-链霉素双抗溶液、胰酶（批号                          2.4 “三色散”挥发油成分相对含量的计算
        分别为 BL505A、BL512A）均购自南京顺捷生物科技有                         采 用 Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis
        限公司；BCA 蛋白检测试剂盒、RIPA 强裂解液、5×十二                     B.06.00 软件系统对所得数据进行处理。各色谱峰对应
        烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上                       化学成分的鉴定借助NIST 11标准质谱图库和PubChem
        样缓冲液（批号分别为P0012、P0013B、P0015）均购自上                  数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），结合各色谱
        海碧云天生物技术有限公司；DMEM 培养基（批号                           峰的保留时间，保留并展示匹配度＞80％的结果。同
        10-013-CV）购自美国 Corning 公司；脂多糖（LPS，批号               时，采用面积归一化法计算各成分的相对含量。
        L2630）购自美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯或实                      2.5  FLS的提取与培养
        验室常用规格，水为超纯水。                                          脱颈处死 5 只雄性 SD 大鼠，消毒后切开其膝关节，
        1.3  动物                                            取出滑膜组织并置于无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）
            本研究所用实验动物为 SPF 级 SD 雄性大鼠，体质                    中，反复冲洗 3 次。用剪刀将上述组织剪成大小约 1
        量 180～200 g，2 月龄，由浙江省医学科学院提供，动物                    mm×1 mm的小块，用0.2％的Ⅰ型胶原酶于37 ℃下消化
        生产许可证号为 SCXK（浙）2019-0002。所有大鼠均分                    2 h；经 70 μm 筛网滤过后，以 1 000 r/min 离心 5 min，沉
        笼饲养于室温（25±2）℃、相对湿度（60±5）％、每天照                      淀用含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗的DMEM
        明12 h的动物房内，并自由摄食、饮水。                               培养基（以下简称“完全培养基”）重悬于细胞培养皿中，
        2 方法                                               在 37 ℃、5％CO2细胞培养箱中培养（培养条件下同）过
        2.1 “三色散”挥发油的提取                                    夜，24 h 后换液，随后每 2 天换液 1 次。待细胞融合至
            采取水蒸气蒸馏法提取。称取“三色散”粉剂 150                       80％～90％时，用0.25％胰酶消化传代。使用第3～6代
        g，置于 5 L 圆底烧瓶中，加水 3 L 和沸石 5～8 粒，混匀，                的细胞进行实验，以确保其活性及生物特性。
        静置 5 min。将圆底烧瓶置于可调温电热套中，连接挥                        2.6 “三色散”挥发油对FLS存活率的影响检测
        发油提取器、冷凝管，于 50 ℃加热约 5 h（注意避光操                          采用CCK-8法进行检测。取“2.5”项下对数生长期
        作），用棕色小瓶接收挥发油，加入一定量的无水硫酸钠                          的细胞，以8×10 mL 的密度按每孔100 μL接种至6孔
                                                                         3
                                                                             －1
        进行脱水处理并计算提取率：提取率（％）＝“三色散”挥                         板中，培养24 h。将细胞随机分为正常对照组和不同质
        发油质量/“三色散”粉剂质量×100％。上述提取过程平                        量浓度“三色散”挥发油组（10、25、50、100、250、500、
        行9份操作。                                             1 000 μg/mL，质量浓度参考前期预实验结果设置），同时
        2.2 “三色散”挥发油样品的处理                                  设置不含细胞和药物的空白对照组，每组设置 3 个复
            称取经无水硫酸钠干燥后的“三色散”挥发油约0.1                       孔。吸弃培养基，空白对照组和正常对照组加入完全培
        g，溶于乙酸乙酯 1 mL 中，混匀，以 12 000 r/min 离心 10            养基 100 μL，各给药组加入含相应药物的完全培养基
        min，取上清液 200 μL 进行 GC-MS 法分析（每份挥发油                 100 μL。培养 24 h 后，各孔加入 CCK-8 试剂 10 μL 继续


        中国药房    2021年第32卷第19期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 19  ·2337 ·
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