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Oct2019、Oct2019）购自上海泛柯实业有限公司；LDH检                  2.5 H9c2心肌细胞上清液中TNF-α和IL-6水平的检测
        测试剂盒、GSH-Px 检测试剂盒（批号分别为 20190910、                      采用ELISA法进行检测。取对数生长期的H9c2心
                                                                          4
        20190905）均购自南京建成生物工程研究所；其余试剂                       肌细胞，以 5×10 mL      －1 的密度接种于 96 孔板中，每孔
        均为分析纯或实验室常用规格，水为超纯水。                               100 μL，按“2.2”项下分组、造模与给药，每组设置3个复
        1.3 细胞                                             孔。各组细胞培养结束后，收集培养液，于 4 ℃条件下
            本研究所用大鼠H9c2心肌细胞购自中国科学院上                        以 3 000 r/min 离心 10 min；取上清液，按相应试剂盒说
        海生科院细胞资源中心。                                        明书方法操作，采用酶标仪于450 nm波长下，检测细胞
        2 方法                                               上清液中TNF-α和IL-6的水平。
        2.1 细胞培养                                           2.6 H9c2心肌细胞凋亡情况的检测
            将大鼠 H9c2 心肌细胞培养于含 10％ 胎牛血清和                        采用 AO/EB 染色法进行检测。取对数生长期的
                                                                                    －1
        1％青-链霉素的低糖DMEM培养基（含5.5 mmol/L葡萄                    H9c2 心肌细胞，以 1×10 mL 的密度接种于 6 孔板中，
                                                                                5
        糖，下同）中，置于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养至融合度                     每孔1 mL，按“2.2”项下方法分组、造模与给药，每组设3
        达 70％～80％时，以含 0.25％乙二胺四乙酸（EDTA）的                   个复孔。各组细胞培养结束后，按试剂盒说明书相关方
        胰酶消化并传代培养，取对数生长期的细胞进行后续                            法染色 5 min，然后采用荧光显微镜观察各组细胞的凋
        实验。                                                亡情况（AO能透过正常细胞的细胞膜，从而嵌入细胞核
        2.2 分组、造模与给药                                       使细胞呈绿色荧光；EB仅能透过受损细胞的细胞膜，从
            参考文献[9]的方法，将对数生长期的 H9c2 心肌细                    而嵌入细胞核使细胞呈橘红色荧光）。
        胞分为正常组、高糖组、渗透压对照组（以考察由高糖引                          2.7 H9c2心肌细胞中凋亡相关蛋白表达和NF-κB/IκBα
        起的渗透压改变是否会造成细胞损伤）和DMDD高、中、                         通路相关蛋白磷酸化水平的检测
        低浓度组（8、4、2 μmol/L，浓度根据本课题组前期研究结                        采用 Western blot 法进行检测。将对数生长期的
        果设置）。正常组和高糖组细胞分别加入低糖、高糖（含                          H9c2心肌细胞，接种到直径为70 mm的培养皿中，待细
        33.3 mmol/L 葡萄糖，下同）DMEM 培养基培养 48 h；渗               胞生长至融合度达80％ 时，按“2.2”项下方法分组、造模
        透压对照组细胞加入含 27.5 mmol/L 甘露醇的低糖                      与给药。各组细胞培养结束后，弃去培养液，以 PBS 洗
        DMEM培养基培养48 h；DMDD各浓度组细胞先加入高                       涤 3 次，加入裂解液于冰上充分裂解细胞 15 min 后，于
        糖 DMEM 培 养 基 培 养 24 h 后 ，再 加 入 含 相 应 浓 度           4 ℃条件下以 12 000 r/min 离心 15 min；收集上清液，采
        DMDD的高糖DMEM培养基继续培养24 h。                            用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经变
        2.3  H9c2心肌细胞存活率的检测                                性处理后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
            取对数生长期的H9c2心肌细胞，以5×10 mL 的密                    （SDS-PAGE），转膜；以TBST缓冲液清洗5 min×3次，加
                                                  －1
                                              4
        度接种于 96 孔板中，每孔 100 μL，按“2.2”项下方法分                  入cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、
        组、造模与给药，另设不含培养基和细胞的空白组，每组                          IκBα、p-IκBα、GAPDH的一抗（稀释度均为1 ∶ 1 000），于
        设置3个复孔。各组细胞培养结束后，每孔加入含 10％                         4 ℃条件下孵育过夜；以 TBST 洗涤5 min×3次，加入二
        MTT 的低糖 DMEM 培养基 100 μL，继续培养 4 h；弃去                抗（稀释度为1∶5 000），室温孵育1 h，置于双红外荧光成
        培养基，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，避光振荡 15                    像仪中成像。采用 Image J 1.8.0 软件进行分析，以
        min；采用酶标仪于 490 nm 波长下检测每孔吸光度                       p-NF-κB p65与NF-κB p65的蛋白灰度值比值、p-IκBα与
       （OD）值，并计算细胞存活率[细胞存活率（％）＝（实验组                        IκBα的蛋白灰度值比值分别表示NF-κB p65、IκBα蛋白
        OD 值－空白组 OD 值）/（正常组 OD 值－空白组 OD                    的磷酸化水平，以 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 与内参
        值）×100％]。                                          GADPH 的蛋白灰度值比值表示 3 种蛋白的表达水平。
        2.4 H9c2 心肌细胞上清液中 ROS、GSH-Px 和 LDH 活               实验重复3次。
        性的检测                                               2.8 统计学方法
            取对数生长期的H9c2心肌细胞，以5×10 mL 的密                        采用 SPSS 17.0 软件对数据进行统计分析，结果以
                                              4
                                                  －1
        度接种于 96 孔板中，每孔 100 μL，按“2.2”项下方法分                  x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
        组、造模与给药，每组设置3个复孔。各组细胞培养结束                          比较采用LSD检验。检验水准α＝0.05。
        后，收集培养液，于 4 ℃条件下以 3 000 r/min 离心 10                3 结果
        min；取上清液，按相应试剂盒说明书方法操作，然后采                         3.1 DMDD 对高糖诱导的 H9c2 心肌细胞存活率的
        用酶标仪分别于450、412、450 nm波长下，检测细胞上清                    影响
        液中ROS、GSH-Px、LDH的活性。                                   与正常组比较，高糖组细胞存活率显著降低（P＜


        中国药房    2021年第32卷第15期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 15  ·1807 ·
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