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2 方法 释比例为 1 ∶ 3 000），室温孵育 1 h；用 TBST 缓冲液清洗
2.1 TPME的制备 10 min×3次，用ECL Plus超敏发光液显影并置于凝胶成
取黄水枝全草，粉碎成粗粉，过 24 目筛；称取粗粉 像分析仪上成像。采用Image J 1.8.0 软件分析条带的灰
200 g，第 1 次加入甲醇 2 000 mL，浸泡 1 h 后，加热回流 度值，以目标蛋白与内参 GAPDH 的灰度值比值作为目
提取 1 h；第 2 次加入等体积甲醇，加热回流提取 1 h；合 标蛋白的表达水平。
并两次提取液，滤过，取滤液，减压回收溶剂，冷冻干燥 2.6 肝组织病理学观察
后即得干浸膏44.58 g，提取率为22.29％。 取固定于 4％多聚甲醛溶液中的肝组织，经乙醇脱
2.2 分组、造模与给药 水、石蜡包埋后切片，分别经HE、Masson染色后，于光学
造模方法根据文献[9]及预实验结果确定，按体质量 显微镜下观察各组小鼠肝组织的病理学变化。
随机将60只雄性昆明种小鼠分为正常组、模型组、阳性 2.7 统计学方法
对照组（秋水仙碱 0.1 mg/kg）和 TPME 低、中、高剂量组 采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。所有数
（250、500、1 000 mg/kg，剂量按临床用药剂量的0.5、1、2 据均为计量资料，以 x±s 表示，多组间比较采用单因素
倍设置），每组10只。除正常组小鼠腹腔注射等体积橄 方差分析，方差齐时两两比较采用 LSD 检验，方差不齐
榄油外，其余5组小鼠均腹腔注射20％CCl4橄榄油溶液 时则采用Dunnett’s T3检验。检验水准α＝0.05。
（橄榄油与 CCl4的体积比为 4 ∶ 1）1 mL/kg 以建立肝纤维 3 结果
化模型，每周 2 次，连续 8 周。从造模的第 5 周起，正常
3.1 TPME对肝纤维化模型小鼠肝指数的影响
组、模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，各给药组小鼠灌
与正常组比较，模型组小鼠的肝指数显著升高（P＜
胃相应药液（以生理盐水为溶剂），每天 1 次，连续 4 周。
0.01）。与模型组比较，阳性对照组和TPME各剂量组小
末次给药后，所有小鼠均禁食、不禁水12 h，再称定其体
鼠的肝指数均显著降低（P＜0.01），而TPME各剂量组上
质量；腹腔注射戊巴比妥进行麻醉，于眼眶取血约1 mL，
述指标组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05），详见
常温静置 2 h，以 3 500 r/min 离心 15 min，取血清，保存
表1。
于－20 ℃，备用。采血后，脱颈椎处死小鼠，剖取其肝
表1 TPME对肝纤维化模型小鼠肝指数的影响（x±±s，
脏，称定质量，部分肝组织固定于4％多聚甲醛溶液中保
n＝10，％％）
存，备用；另一部分肝组织于－80 ℃冰箱中保存，备用。
Tab 1 Effects of TPME on liver index in hepatic fibro-
2.3 脏器指数计算
sis model mice（x±±s，n＝10，％％）
计算各组小鼠末次给药后的肝指数：肝指数＝肝质
组别 剂量，mg/kg 肝指数
量/末次体质量×100％。
正常组 4.36±0.25
2.4 血清生化指标检测 模型组 5.49±0.23 ＊＊
采用微板法以酶标仪检测各组小鼠血清中 ALT、 阳性对照组 0.1 4.52±0.24 ##
TPME低剂量组 250. 4.40±0.26 ##
AST 的活性，ELISA 法以酶标仪检测血清中 PC-Ⅲ、C- TPME中剂量组 500. 4.34±0.39 ##
Ⅳ、LN、TNF-α、IL-6 的含量，TBA 法以酶标仪检测血清 TPME高剂量组 1 000. 4.17±0.32 ##
##
中 MDA 的含量，WST-1 法以酶标仪检测血清中 SOD 的 注：与正常组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.01
＊＊
##
＊＊
活性。上述检测均严格按相应试剂盒说明书操作。 Note：vs. normal group， P＜0.01；vs. model group， P＜0.01
2.5 肝组织中α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表达检测 3.2 TPME对肝纤维化模型小鼠血清中ALT和AST活
采用Western blot法进行检测。取于－80 ℃冻存的 性的影响
肝组织，复温后，称取每个肝组织样本 100 mg，加高效 与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST的活
RIPA 裂解液 1 mL，于冰上匀浆，再于 4 ℃下以 12 000 性均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性对照组
r/min 离心 10 min，取上清液，即得各组小鼠肝组织蛋 和 TPME 各剂量组小鼠血清中 ALT 和 AST 的活性均显
白。采用 BCA 法测定肝组织样本的蛋白浓度，加入 5× 著降低（P＜0.01），而TPME各剂量组上述指标组间比较
蛋白上样缓冲液，于100 ℃加热5 min变性；取变性蛋白 差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表2。
进行10％SDS-PAGE，采用湿转法转移至PVDF膜上，用 3.3 TPME 对肝纤维化模型小鼠血清中 PC-ⅢⅢ、C-ⅣⅣ、
5％脱脂奶粉室温封闭 1.5 h；用 TBST 缓冲液清洗 10 LN含量的影响
min×3 次后，分别加入α-SMA、TGF-β 1、Smad3、GAPDH 与正常组比较，模型组小鼠血清中PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN
一抗（稀释比例均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；用 TBST 的含量均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性对
缓冲液清洗 10 min×3 次后，加入山羊抗兔 IgG 二抗（稀 照组和 TPME 各剂量组小鼠血清中 PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN 的

中国药房 2021年第32卷第14期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 14 ·1687 ·