Page 62 - 《中国药房》2021年13期

后，用无血清F12K培养基洗涤细胞3次，以充分去除未 形态饱满、均一性好，详见图1。以CS-GO-oridonin培养
进入细胞内的游离 DCFH-DA。收集各组细胞，用 PBS 至24 h时，细胞出现了皱缩、不规则现象，且可见其成团
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500 μL 重悬，调整细胞密度为 1×10 mL ，使用流式细 脱落、悬浮状的现象增多，详见图2。
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胞仪检测细胞中ROS的含量。
2.8 CS-GO-oridonin 对 A549 细 胞 中 的 Mcl-1、Bax、
Bak蛋白表达水平的影响检测
采用Western blot法进行检测。收集“2.2”项下对数
期细胞，按“2.6”项下方法分组（每组设 3 个复孔）、给
药。细胞培养24 h后，提取其蛋白并采用BCA法测定蛋
白浓度。将蛋白置于沸水浴中10 min使变性，取变性蛋 A.培养2 h B.培养4 h
白20 μg，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电泳后，
蛋白以湿转法转移至 PVDF 膜上，以 5％脱脂奶粉室温
封闭 1 h；加入 Mcl-1、Bax、Bak、GAPDH 一抗（稀释度均
为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；用 PBST 溶液洗涤 5 min×3
次，加入 HRP 标记的 IgG 二抗（稀释度为 1 ∶ 10 000），室
温孵育 1 h；用 PBST 溶液洗涤 5 min×3 次，以 ECL 显色，
C.培养10 h D.培养24 h
于全自动化学发光分析仪上成像。使用 Tanon GIS 4.2
软件分析各蛋白条带灰度值，以目标蛋白与内参GAPDH 图1 不同培养时间下CS-GO对A549细胞形态的影响
（×100）
条带的灰度值比值作为目标蛋白的表达水平。
2.9 统计学方法 Fig 1 Effects of CS-GO on the morphology of A549
用 Graphpad Prism 6.0 软件对数据进行统计分析。 cells under different culture time（×100）
数据以 x±s 或 x 表示，组间比较采用单因素方差分析。
检验标准α＝0.05，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 CS-GO-oridonin对A549细胞的抑制作用
当培养时间为24 h时，不同质量浓度CS-GO组细胞
的存活率均在90％以上；而不同质量浓度CS-GO-orido-
nin组细胞的存活率均较空白组显著降低，且显著低于 A.培养2 h B.培养4 h
同质量浓度 CS-GO 组（P＜0.01），且 CS-GO-oridonin 48
μg/mL组细胞的存活率仅为（27.12±0.01）％，详见表 1。
CS-GO-oridonin的IC50值为32.61 μg/mL。
表 1 不同质量浓度 CS-GO、CS-GO-oridonin 对 A549
细胞存活率的影响（x±±s，n＝6）
Tab 1 Effects of different concentration of CS-GO
C.培养10 h D.培养24 h
and CS-GO-oridonin on survival rate of A549
图2 不同培养时间下CS-GO-oridonin对A549细胞形
cells（x±±s，n＝6）
态的影响（×100）
组别 存活率，％ 组别 存活率，％ Fig 2 Effects of CS-GO-oridonin on the morphology
空白组 100 CS-GO-oridonin 3 μg/mL组 85.18±0.01 ＊＊##
CS-GO 3 μg/mL组 90.60±0.03 CS-GO-oridonin 6 μg/mL组 82.62±0.02 ＊＊## of A549 cells under different culture time（×100）
CS-GO 6 μg/mL组 91.81±0.03 CS-GO-oridonin 12 μg/mL组 73.05±0.01 ＊＊## 3.3 CS-GO-oridonin被A549细胞摄取的情况
CS-GO 12 μg/mL组 93.96±0.01 CS-GO-oridonin 24 μg/mL组 75.02±0.01 ＊＊##
CS-GO 24 μg/mL组 91.78±0.02 CS-GO-oridonin 48 μg/mL组 27.12±0.01 ＊＊## CS-GO、冬凌草甲素和 CS-GO-oridonin 被 A549 细
CS-GO 48 μg/mL组 91.23±0.03
胞摄取情况的显微图见图 3（图中，DAPI 表示染色后呈
##
注：与空白组比较， P＜0.01；与同质量浓度CS-GO组比较，P＜
＊＊
蓝色荧光的细胞核，FITC表示被细胞摄取后呈绿色荧光
0.01
的 CS-GO 空白载体或冬凌草甲素或 CS-GO-oridonin，
Note：vs. blank group， P＜0.01；vs. the same concentration of
＊ ＊
##
CS-GO group，P＜0.01 Merge表示两者叠加）。由图3可见，当细胞摄取CS-GO
3.2 CS-GO-oridonin对A549细胞形态学的影响 后，其荧光较弱；而当细胞摄取冬凌草甲素、CS-GO-ori-
以 CS-GO 培养至 24 h 时，细胞形态仍保持正常，且 donin后，其荧光均有所增强。
·1592 · China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 13 中国药房 2021年第32卷第13期