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2 方法                                               2.5 CS-GO-oridonin被A549细胞摄取情况观察
        2.1 CS-GO、CS-GO-oridonin的制备                            取适量 CS-GO、冬凌草甲素、CS-GO-oridonin 分散
            称取 GO 适量，加水超声使分散均匀并定容，制得                       在PBS中，加入适量FITC试剂，在避光条件下磁力搅拌
        GO 质量浓度为 2 mg/mL 的分散液。取 CS 适量，加入                   12 h。将上述溶液以 13 700×g 离心 30 min，收集离心管
        2％醋酸溶液，于室温下搅拌 6 h 至完全溶解并定容，制                       中的下层沉淀，并用 PBS 多次洗涤，直至上清液中不含
        得 CS 质量浓度为 2 mg/mL 的溶液。将上述 GO 分散液                  游离 FITC，即得 FITC 荧光标记的 CS-GO、冬凌草甲素、
        和CS溶液等体积混合，于室温下搅拌72 h后，以13 700×                    CS-GO-oridonin。取“2.2”项下对数期细胞，以完全培养
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        g离心30 min；取沉淀，用大量2％醋酸溶液洗涤（以除去                      基重悬制成细胞悬液，按 5×10 mL 接种于 96 孔板中，
        未反应完全的 CS）后，于 4 ℃下以水透析 72 h（白天每 3                  每孔 180 µL，培养过夜。待细胞贴壁后，分别加入含相
        h 换水 1 次，晚上每 9 h 换水 1 次），冷冻干燥后即得                   应质量浓度且经FITC标记的CS-GO空白载体或冬凌草
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        CS-GO 。称取冬凌草甲素对照品适量，用乙醇溶解                          甲素或 CS-GO-oridonin（质量浓度同“2.4”项），再加入
        后，与用水分散的CS-GO按质量比1 ∶ 1混合并在室温下                      2％胎牛血清的F12K培养基180 μL，于37 ℃孵育4 h；用
        搅拌24 h，即得CS-GO-oridonin（每克产物含冬凌草甲素                 PBS 冲洗 3 次，置于 4％多聚甲醛溶液中室温固定 30
        0.428 g）。                                          min；用 PBS 冲洗 3 次，弃去 PBS 后，加入抗荧光淬灭封
        2.2 细胞培养                                           片液（含 DAPI）50 μL，反应 15 min 后，置于倒置荧光显
            将 A549 细胞接种于含 10％胎牛血清的 F12K 培养                 微镜下观察其摄取情况并拍照。
        基（以下简称“完全培养基”），置于37 ℃、5％CO2培养箱                     2.6 CS-GO-oridonin对A549细胞凋亡的影响考察
        中培养（培养条件下同），待细胞生长至融合时，以                                采用 Annexin V-FITC/PI 双染法以流式细胞仪进行
        0.25％胰蛋白酶消化，继续培养，待细胞生长至对数期时                        检测。取“2.2”项下对数期细胞，以完全培养基重悬制成
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        进行后续实验。                                            细胞悬液，按5×10 mL 接种于96孔板中，每孔180 μL，
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        2.3  CS-GO-oridonin对A549细胞抑制作用的考察                  培养过夜。待细胞贴壁后，将其随机分为空白组、
            采用CCK-8法进行检测。收集“2.2”项下对数期细                     CS-GO 不同质量浓度组（16、32、64 μg/mL）、CS-GO-ori-
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        胞，以完全培养基重悬制成细胞悬液，按 5×10 mL 接                       donin 不同质量浓度组（16、32、64 μg/mL，以冬凌草甲素
        种于 96 孔板中，每孔 180 µL，培养过夜。待细胞贴壁                     计，质量浓度按“2.3”项下所得 IC50的 1/2、1、2 倍设置）。
        后，将其随机分为空白组、CS-GO不同质量浓度组（3、6、                      空白组加入含 2％胎牛血清的 F12K 培养基 2 mL，其余
        12、24、48 μ g/mL，以 CS-GO 的 整 体 质 量 计 ，下 同）、         各组加入含相应质量浓度 CS-GO 空白载体或 CS-GO-
        CS-GO-oridonin不同质量浓度组（3、6、12、24、48 μg/mL，          oridonin，再加入2％胎牛血清的F12K培养基2 mL，继续
                      [10]
        以冬凌草甲素计 ，下同），每组设 6 个复孔。空白组加                        培养 24 h；弃去培养基，以 PBS 清洗后，用 0.25％胰蛋白
        入含2％胎牛血清的F12K培养基180 μL，其余各组加入                      酶消化，吸除多余的胰蛋白酶消化液；加入完全培养基
        含相应质量浓度CS-GO空白载体或CS-GO-oridonin，再                  轻轻吹打并收集细胞，以 1 000×g 离心 5 min，弃去上清
        加入 2％胎牛血清的 F12K 培养基 180 μL；同时，设置仅                  液，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5万～10
        含完全培养基的凋零孔。各组细胞继续培养24 h后，每                         万个重悬的细胞，于 4 ℃下以 1 000×g 离心 5 min，弃去
        孔加入 CCK-8 试剂 20 μL，继续培养 4 h；使用酶标仪于                 上清液；加入预冷 PBS 1 mL，轻轻振荡使细胞悬浮，于
        450 nm 波长处测量各孔的光密度（OD）值，计算细胞存                      4 ℃下以1 000×g离心5 min，弃去上清液，再次重复此过
        活率[细胞存活率＝（检测组细胞 OD 值－调零孔细胞                         程 2 次。将上述处理后的细胞重悬于 binding buffer 200
        OD 值）/（空白组细胞 OD 值－调零孔细胞 OD 值）×                     μL中，依次加入Annexin V-FITC试剂和PI试剂各10 μL，
        100％]，并通过SPSS 22.0软件计算CS-GO-oridonin的半             轻轻混匀，于 4 ℃下避光孵育 30 min；再加入 binding
        数抑制浓度（IC50 ）。                                      buffer 300 μL，用流式细胞仪检测细胞总凋亡率（细胞总
        2.4 CS-GO-oridonin对A549细胞形态的影响观察                   凋亡率＝早期凋亡率+晚期凋亡率）。
            收集“2.2”项下对数期细胞，以完全培养基重悬制成                      2.7 CS-GO-oridonin 对 A549 细胞中 ROS 含量的影响
        细胞悬液，按5×10 mL 接种于96孔板中，每孔180 µL，                   考察
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        培养过夜。待细胞贴壁后，分别加入含相应质量浓度                                收集“2.2”项下对数期细胞，按“2.6”项下方法分组
        CS-GO 空白载体或 CS-GO-oridonin（32 µg/mL，质量浓            （每组设3个复孔）、给药。细胞培养5 h后，将其重悬于
        度按“2.3”项下所得 IC50设置），再加入 2％胎牛血清的                    DCFH-DA 溶 液（用 无 血 清 的 F12K 培 养 基 稀 释 至
        F12K 培养基 180 μL，分别培养 2、4、10、24 h。于上述时              DCFH-DA 终浓度为 10 μmol/L）1 mL 中，调整细胞密度
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        间点取细胞适量，用PBS洗涤3次，置于倒置荧光显微镜                         为1×10 mL ，于37 ℃下孵育20 min（每隔3 min颠倒混
        下观察其形态并拍照。                                         匀1次），使DCFH-DA探针和细胞充分接触。孵育结束

        中国药房    2021年第32卷第13期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 13  ·1591 ·
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