Page 29 - 《中国药房》2021年13期

中振荡 8 h，再经过滤、抽滤后，得第 1 次滤液；将残渣回 4 200 3 200
3 500
收至三角瓶中，加入经柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH 2 400
2 800
4.0）反复洗脱后的果胶酶液 500 mL（酶含量为 5％），置 mAU 2 100 mAU 1 600
于 50 ℃恒温水浴中振荡 8 h，再经过滤、抽滤后，得第 2 1 400 超滤前供试品溶液 超滤前供试品溶液
超滤后供试品溶液 800 超滤后供试品溶液
次滤液；再将残渣回收至三角瓶中，加入经柠檬酸-柠檬 700
桃叶珊瑚苷对照品溶液 京尼平苷酸对照品溶液
酸钠缓冲溶液（pH 5.5）反复洗脱后的纤维素酶液 500 0 0
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
mL（酶含量为5％），置于55 ℃恒温水浴中振荡8 h，再经 t，min t，min
A.桃叶珊瑚苷 B.京尼平苷酸
过滤、抽滤后，得第3次滤液；再次将残渣回收至三角瓶
500
中，加入经柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH 4.8）反复洗脱
400
后的酸性木聚糖酶液500 mL（酶含量为6％），置于45 ℃ 超滤前供试品溶液
300
恒温水浴中振荡 8 h，再经过滤、抽滤后，得第 4 次滤液； mAU 超滤后供试品溶液
合并上述 4 次滤液，即得 25 g/L（以生药量计）的杜仲翅 200
100
果皮酶解提取液。
0 绿原酸对照品溶液
2.2 杜仲翅果皮酶解提取液中桃叶珊瑚苷、京尼平苷 0 2 4 6 8 10
t，min
酸、绿原酸的含量测定 C.绿原酸
2.2.1 色谱条件 参考文献[19]的方法并进行优化后进
图2 专属性考察的高效液相色谱图
行测定。色谱柱为 WondaSil C18 Superb（4.6 mm×250
Fig 2 HPLC chromatograms of specificity tests
mm，5 μm）；桃叶珊瑚苷的流动相为乙腈-水溶液（10 ∶
品溶液适量，分别以 50％甲醇稀释，制成桃叶珊瑚苷质
90，V/V），流速为 0.8 mL/min，进样量为 10 μL，柱温为
量 浓 度 为 0.001 0、0.025 0、0.050 0、0.075 0、0.100 0、
25 ℃，检测波长为 204 nm；京尼平苷酸的流动相为乙
0.120 0、0.150 0、0.210 0 mg/mL，京尼平苷酸质量浓度为
腈-0.2％磷酸水溶液（16 ∶ 84，V/V），流速为 0.8 mL/min，
0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.250 0、0.450 0、0.600 0、0.750 0、
进样量为10 μL，柱温为35 ℃，检测波长为238 nm；绿原
0.800 0 mg/mL，绿原酸质量浓度为 0.000 5、0.001 0、
酸的流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液（24 ∶ 76，V/V），流速
0.002 0、0.007 5、0.010 0、0.015 0、0.020 0、0.030 0 mg/mL
为 0.7 mL/min，进样量为 15 μL，柱温为 40 ℃，检测波长
的系列对照品溶液。按照“2.2.1”项下的色谱条件进样
为330 nm。
分析，以质量浓度为横坐标（x，mg/mL）、峰面积为纵坐
2.2.2 单一对照品溶液制备 精密称取桃叶珊瑚苷对
标（y）进行线性回归，结果见表1。
照品2.10 mg、京尼平苷酸对照品8.00 mg、绿原酸对照品
表1 桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的线性关系考察
1.71 mg，分别置于 10 mL 量瓶中，以 50％甲醇溶解并定
结果
容，制成质量浓度分别为 0.21、0.80、0.17 mg/mL 的单一
Tab 1 Results of linear range of aucubin，geniposidic
对照品溶液。
acid and chlorogenic acid
2.2.3 供试品溶液制备 取“2.1”项下杜仲翅果皮酶解
成分 线性回归方程 线性范围，mg/mL 相关系数（R）
2
提取液适量，进行澄清膜除杂处理（如图 1 第 2 步所示，
桃叶珊瑚苷 y＝17 023x+6.861 4 0.001 0～0.210 0 0.999 8
以预先除去提取液中的微生物、悬浮胶体、色素等杂质， 京尼平苷酸 y＝5 589.8x+69.924 0.025 0～0.800 0 0.999 5
下同）；取澄清膜除杂处理后的溶液，进行高压膜分离纯 绿原酸 y＝25 934x+10.108 0.000 5～0.030 0 0.999 2
化（如图1第3步所示），以制备超滤透过液；然后取超滤 2.2.6 精密度考察 取“2.2.5”项下桃叶珊瑚苷质量浓
透过液适量，以 8 000 r/min 离心 30 min，取上清液经 度为 0.075 0 mg/mL、京尼平苷酸质量浓度为 0.250 0
0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得超滤后供试品溶液。另取 mg/mL、绿原酸质量浓度为 0.010 0 mg/mL 的对照品溶
适量杜仲翅果皮酶解提取液按上述“以 8 000 r/min…… 液适量，分别按照“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记
过滤”方法操作，即得超滤前供试品溶液。 录峰面积。结果，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸峰面
2.2.4 专属性考察 取“2.2.2”和“2.2.3”项下单一对照 积的 RSD 分别为 1.07％、0.79％、0.86％（n＝6），表明仪
品溶液和超滤前后供试品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱 器的精密度良好。
条件进样分析，记录色谱图。结果，超滤前后供试品溶 2.2.7 稳定性考察 取“2.2.3”项下超滤后供试品溶液6
液中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸的理论板数均大 份，于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时，按照“2.2.1”项下
于 30 000，分离度均大于 1.5，且超滤后上述成分色谱峰 色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，桃叶珊瑚苷、京
的峰形更好、分离度更大，说明超滤可以降低杂质对检 尼平苷酸、绿原酸峰面积的 RSD 分别为 1.72％、1.26％、
测的干扰，详见图2。 1.47％（n＝6），表明超滤后供试品溶液在室温下放置24
2.2.5 线性关系考察 分别取“2.2.2”项下各单一对照 h内稳定性良好。

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