Page 33 - 中国药房2021年11期
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        5×10 mL 的密度接种至 6 孔板中，每孔 2 mL，按“2.3”                胞核固缩、致密浓染，可见大量凋亡小体；与模型组比
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        项下方法分组（每组设3个复孔）、造模和给药处理后，以                         较，荭草花提取物各浓度组细胞核固缩现象减轻，凋亡
        PBS洗涤2次；加入胰酶1 mL消化2 min后，加入完全培                     小体数量减少，详见图1。
        养基终止消化；以 1 000 r/min 离心 3 min，弃上清液，收
        集沉淀，按照细胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒说明书
        方法操作，提取细胞质和线粒体中的蛋白，备用。另外，
        按上述方法对H9c2心肌细胞分组（每组设3个复孔）、造
        模和给药处理后，以预冷的 PBS 洗涤 3 次，加入 RIPA
        裂解液（含 1％ PMSF）冰浴裂解细胞 5 min，于 4 ℃以
        12 000 r/min 转速离心 10 min，收集上清液，得细胞总蛋                       A.正常对照组                  B.模型组
        白，备用。取线粒体蛋白、细胞质蛋白、总蛋白适量，使
        用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；蛋白经变性后进
        行SDS-PAGE电泳，转膜，加入5％BSA溶液封闭2 h，然
        后 分 别 加 入 Cyto c、Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、
        HIF-1α、β-actin 一抗（稀释度均为 1 ∶ 1 000），室温孵育 2
        h；以TBST洗涤5 min×5次，加入相应二抗（稀释度均为
        1 ∶ 8 000），室温孵育2 h；以TBST缓冲液洗膜5 min×5次                  C.荭草花提取物低浓度组             D.荭草花提取物中浓度组
        后，加入 ECL 显色，并于凝胶成像系统中进行成像。采
        用Quantity One 4.6软件进行分析，以Cyto c在细胞质中
        灰度值与在线粒体中灰度值的比值表示线粒体膜的开
        放程度（比值越大，则表示线粒体膜开放程度越大）；以
        p-Akt 与 Akt、p-ERK1/2 与 ERK1/2 的灰度值的比值分别
        表示 Akt、ERK1/2 的磷酸化水平；以 HIF-1α与内参β-
        actin的灰度值的比值表示其表达水平。                                                E.荭草花提取物高浓度组
                                                           图 1   荭草花提取物对缺氧复氧损伤 H9c2 心肌细胞凋
        2.10  加入抑制剂后 H9c2 心肌细胞中 RISK 信号通路
                                                                 亡影响的显微图（×200）
        相关蛋白表达水平的检测
                                                           Fig 1 Micrograph of the effects of P. orientale flower
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                                      －1
            将 H9c2 心肌细胞以 5×10 mL 的密度接种至 6 孔
                                                                  extract on the apoptosis of H9c2 cardiomyo-
        板中，每孔2 mL，然后分为正常对照组、模型组、荭草花
                                                                  cytes with hypoxia-reoxygenation injury（×200）
        提取物组（80 μg/mL，浓度根据前期研究设置）、LY+
        CoCl2组（15 μmol/L LY+800 μmol/L CoCl2 ）、LY+荭草花      3.2  荭草花提取物对缺氧复氧损伤 H9c2 心肌细胞中
        提取物组（15 μmol/L LY+80 μg/mL荭草花提取物）、PD+              ROS水平的影响
        CoCl2组（25 μmol/L PD+800 μmol/L CoCl2 ）、PD+荭草花          与正常对照组比较，模型组细胞中ROS水平显著升
        提取物组（25 μmol/L PD+80 μg/mL荭草花提取物），每组               高（P＜0.01）；与模型组比较，荭草花提取物各浓度组细
        设3个复孔。其中，LY和PD给药浓度根据文献[18－20]                      胞中ROS水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），详见图
        设置。除正常对照组、模型组、荭草花提取物组外，其余                          2、表1。
        各组细胞均在造模前加入相应抑制剂预处理20 min，然                        3.3  荭草花提取物对缺氧复氧损伤H9c2心肌细胞中钙
        后再按“2.3”项下方法造模与给药。分组培养完毕后，按                        离子水平（细胞质中）的影响
       “2.9”项下方法提取细胞总蛋白并检测加入抑制剂后                               与正常对照组比较，模型组细胞中钙离子水平（细
        RISK信号通路相关蛋白的表达情况。                                 胞质中）显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，荭草花提
        2.11 统计学分析                                         取物中、高浓度组细胞中钙离子水平（细胞质中）显著降
            采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。所有数据                     低（P＜0.05或P＜0.01），详见图3、表1。
        均以x±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较，P＜                         3.4  荭草花提取物对缺氧复氧损伤 H9c2 心肌细胞
        0.05表示差异有统计学意义。                                    MMP水平的影响
        3 结果                                                   与正常对照组比较，模型组细胞 MMP 水平显著升
        3.1  荭草花提取物对缺氧复氧损伤H9c2心肌细胞凋亡                       高（P＜0.01）；与模型组比较，荭草花提取物各浓度组细
        的影响                                                胞 MMP 水平均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），详见图
            正常对照组细胞形态正常、核染色均匀；模型组细                         4、表1。


        中国药房    2021年第32卷第11期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 11  ·1307 ·
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