Page 32 - 中国药房2021年11期
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（美国 Promega 公司，批号 V7001），细胞质和线粒体蛋 板中，每孔 2 mL，按“2.3”项下方法分组（每组设 3 个复
白 质 提 取 试 剂 盒（中 国 Sangon Biotech 公 司 ，批 号 孔）、造模和给药处理后，弃去培养基；以PBS洗涤2次，
C500051-0050），小鼠源β-actin 单克隆抗体、兔源 Cyto c 每孔加入1×Hoechst 33342染色液1 mL，培养20 min；弃
单克隆抗体、兔源 Akt 多克隆抗体、兔源磷酸化 Akt 去含染料的培养基，以无血清高糖DMEM培养基洗涤3
（p-Akt）多克隆抗体、兔源ERK单克隆抗体、兔源磷酸化 次后，采用荧光显微镜观察并拍照（正常细胞的细胞核
ERK（p-ERK）多克隆抗体、兔源 HIF-1α单克隆抗体、辣 被染成均匀的蓝色，凋亡细胞的细胞核呈碎裂、浓缩的
根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二 明亮蓝色）。
抗、HRP标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（英 2.5 H9c2心肌细胞中ROS水平的检测
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国Abcam公司，批号分别为ab8226、ab133504、ab38449、 将 H9c2 心肌细胞以 5×10 mL 的密度接种至 6 孔
ab8805、ab184699、ab217322、ab179483、ab6721、ab6728）， 板中，每孔 2 mL，按“2.3”项下方法分组（每组设 3 个复
PVDF膜（美国Millipore公司，批号IPVH00010）；其余试 孔）、造模和给药处理后，弃去培养基；按 ROS 检测试剂
剂为实验室常用试剂，水为纯净水。 盒说明书方法操作后，采用荧光显微镜进行观察，并随
1.3 细胞 机选取5个不同视野拍照。利用Image-Pro Plus 6.0软件
分析其绿色荧光强度，以评价细胞中 ROS 水平（绿色荧
本研究所用细胞为大鼠 H9c2 心肌细胞株，购自中
光强度越大，则表示细胞中ROS水平越高）。
国科学院上海生科院细胞资源中心。
2.6 H9c2心肌细胞中钙离子水平（细胞质中）的检测
2 方法
将 H9c2 心肌细胞以 5×10 mL 的密度接种至 6 孔
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2.1 荭草花提取物的制备
板中，每孔 2 mL，按“2.3”项下方法分组（每组设 3 个复
参照本课题组前期研究方法 ，取荭草花药材 7.0
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孔）、造模和给药处理后，弃去培养基，以PBS洗涤3次；
kg，经水提、醇沉后，以水饱和正丁醇溶液萃取，收集正
按Fluo-4 AM钙离子荧光探针检测试剂盒说明书方法操
丁醇层，减压干燥；残渣以80％乙醇溶解，然后上聚酰胺
作后，采用荧光显微镜观察，并随机选取5个不同视野拍
柱，以 80％乙醇进行洗脱；收集洗脱液，减压回收乙醇，
照。利用Image-Pro Plus 6.0软件分析其绿色荧光强度，
残留物采用微波真空干燥器进行干燥，即得荭草花提取
以评价细胞质中钙离子水平（绿色荧光强度越大，则表
物（得率为3.43％）。
示细胞质中钙离子水平越高）。
2.2 细胞培养
2.7 H9c2心肌细胞MMP的检测
将 H9c2 心肌细胞接种到含 10％胎牛血清的高糖
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将 H9c2 心肌细胞以 5×10 mL 的密度接种至 6 孔
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DMEM 培养基（以下简称“完全培养基”）中，于 37 ℃、
板中，每孔 2 mL，按“2.3”项下方法分组（每组设 3 个复
5％CO2条件下培养（下同），待细胞生长至 85％时进行
孔）、造模和给药处理后，弃去培养基，以PBS洗涤1次；
传代，取对数生长期细胞进行后续实验。
按JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明书方法操作后，采
2.3 分组、造模与给药
用荧光显微镜观察并拍照，并随机选取5个不同视野拍
参考文献[3]方法复制缺氧复氧损伤模型。将H9c2
照。利用 Image-Pro Plus 6.0 软件分析绿色和红色荧光
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心肌细胞以 5×10 mL 的密度接种于 96 孔板中，每孔
强度，并以绿色与红色荧光强度的比值评价MMP（比值
100 μL，于 37 ℃、5％CO2条件下培养 24 h 后，弃去上清 越大，则表示细胞MMP越高）。
液；将细胞分为正常对照组、模型组和荭草花提取物低、 2.8 H9c2心肌细胞中ATP酶活性的测定
中、高浓度组（20、40、80 μg/mL，以提取物计，药物质量 将 H9c2 心肌细胞以 5×10 mL 的密度接种至 6 孔
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浓度根据课题组前期研究设置 [3－4] ）。模型组细胞加入 板中，每孔 2 mL，按“2.3”项下方法分组（每组设 3 个复
完全培养基 100 μL，培养 24 h 后，加入终浓度为 800 孔）、造模和给药处理后，以胰蛋白酶消化；收集细胞至
μmol/L 的 CoCl2溶液（临用时以完全培养基溶解制成）， 10 mL离心管中，以1 500 r/min离心3 min，弃上清液，沉
培养22 h以刺激细胞，换为完全培养基继续培养2 h；荭 淀以PBS洗涤2次；加入生理盐水5 mL，于冰浴条件下，
草花提取物低、中、高浓度组细胞分别加入终浓度分别 采用超声破碎仪破碎细胞（功率为 300 W，频率为 40
为20、40、80 μg/mL的荭草花提取物溶液（临用时以完全 kHz，每隔4 s超声1次）；经BCA蛋白定量试剂盒测定蛋
培养基溶解制成）100 μL，培养 24 h 后，按上述“加入终 白浓度后，取适量蛋白，按相应试剂盒说明书方法操作，
浓度为800 μmol/L的CoCl2溶液……换为完全培养基继 测定细胞中 ATP 酶（包括 Na -K -ATP 酶和 Ca -Mg -
+
2 +
+
2 +
续培养2 h”方法操作；正常对照组细胞以完全培养基培 ATP酶）的活性。
养，培养时间与方法同模型组，但不进行造模。 2.9 H9c2心肌细胞中Cyto c蛋白、RISK信号通路相关
2.4 H9c2心肌细胞凋亡的观察 蛋白及HIF-1α蛋白表达水平的检测
将 H9c2 心肌细胞以 5×10 mL 的密度接种至 6 孔 采用Western blot法进行检测。将H9c2心肌细胞以
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·1306 · China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 11 中国药房 2021年第32卷第11期
