Page 31 - 中国药房2021年11期

CoCl2 ）， LY294002+P. orientale flower extract group（15 μmol/L LY294002+80 μg/mL P. orientale flower extract），MEK inhibitor
PD98059 + CoCl2 group （25 μ mol/L PD98059 + 800 μ mol/L CoCl2 ），PD98059 + P. orientale flower extract group （25 μ mol/L
PD98059+80 μg/mL P. orientale flower extract）. After cultured by the same method，the phosphorylation levels of Akt protein and
ERK1/2 protein in the cells were measured to verify the activation of P. orientale flower extract to RISK signaling pathway.
RESULTS： Compared with model group， nuclear pyknosis and the number of apoptotic bodies were reduced in different
concentrations groups of P. orientale flower extract. ROS level，Ca 2 + level（except for low-concentration group），MMP，ratio of
Cyto c in cytoplasm to Cyto c in mitochondria，protein expression of HIF-1α were decreased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）；
the activity of ATP enzyme（except for the low-concentration group），Akt protein and ERK1/2 protein phosphorylation level were
significantly increased（P＜0.01）. After treated with PI3K inhibitor LY294002 and MEK inhibitor PD98059，Akt protein and ERK1/2
protein phosphorylation level in cadiomyocyte were decreased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）. CONCLUSIONS：P. orientale
flower extract can improve hypoxia-reoxygenation injury of H9c2 cardiomyocytes，the mechanism of which may be associated with
inhibiting cardiomyocyte apoptosis，improving ATPase activity，protecting mitochondria，regulating RISK signaling pathway related
proteins and HIF-1α protein expression.
KEYWORDS Polygonum orientale flower extract； H9c2 cardiomyocytes； Hypoxia-reoxygenation injury； RISK signaling
pathway；HIF-1α

荭草为蓼科植物荭草Polygonum orientale L.的干燥 （MMP）、腺苷三磷酸（ATP）酶活性、Cyto c蛋白表达（细
果穗及带叶茎枝，其味辛，性凉，有小毒，归心、肝、胃、大 胞质和线粒体中）、RISK信号通路相关蛋白及HIF-1α蛋
肠经，具有清热解毒、祛风除湿、活血消肿的功效，常用 白表达等的影响，并应用 PI3K 抑制剂 LY294002（简称
于治疗风湿性关节炎、冠心病、心胃气痛、疝气、脚气、疮 “LY”）和 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 激 酶（MEK）抑 制 剂
[1]
肿 。本课题组前期研究发现，荭草的花序（即荭草花） PD98059（简称“PD”） [15－16] ，验证荭草花提取物对 RISK
具有明显的抗心肌缺血、抗氧化损伤的作用 [2－5] ，且对 信号通路的激活作用，从而探讨荭草花改善 H9c2 心肌
H9c2心肌细胞的过氧化氢损伤和缺氧复氧损伤具有明 细胞缺氧复氧损伤的作用机制，为其进一步开发利用提
显的改善作用 [3－4] 。但是，荭草花抗心肌细胞缺氧复氧 供科学依据。
损伤的作用机制尚不明确。 1 材料
线粒体在参加和调节心肌细胞的损伤方面发挥着 1.1 主要仪器
[6]
重要作用 。严重的缺氧环境会损伤线粒体的电子传递 本研究所用主要仪器有：Forma 321 型 CO2细胞培
[7]
链 ，从而损伤线粒体，因此在复氧过程中，由于受损线 养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），TS100型倒置
粒体的驱动，使得大量活性氧（ROS）产生、钙离子失调， 显 微 镜（日 本 Nikon 公 司），Model 680 型 酶 标 仪 、
进而改变线粒体的通透性，导致线粒体肿胀和损伤 [6，8] ； Trans-Blot Turbo 蛋白转移系统、Power Pac Basic 型电泳
另外，受损的线粒体还可导致线粒体的功能失调，从而 仪（美国 Bio-Rad 公司），Allegra 64R 型冷冻高速离心机
释放细胞色素 c（Cyto c）进入细胞质，激活级联凋亡反 （美国 Beckman 公司），GBOX chemi XL1.4 型凝胶成像
[9]
应 ，进而激活线粒体的重构和细胞内调节细胞存亡的 仪（英国Sysgene公司），R-100型旋转蒸发仪（瑞士Buchi
[6]
反应 ，最终导致细胞的凋亡和坏死。因此，保护线粒体 公司）。
是治疗心肌细胞损伤的重要环节。 1.2 主要药品与试剂
Hausenloy等 提出了再灌注损伤补救激酶（RISK） 荭草花药材采收于贵州省贵阳市鹿冲关植物园，经
[10]
的概念，且相关研究已经证实 RISK 信号通路在心肌缺 贵州医科大学药学院中药民族药标本馆龙庆德副教授
[11]
血/再灌注损伤中具有关键作用 。RISK由磷脂酰肌醇 鉴定为蓼科植物荭草 P. orientale 的干燥花序。其他药
3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和细胞外信号调节激酶1/2 品与试剂有：BCA 蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有
（ERK1/2）这两条信号通路组成，当RISK被激活时，可显 限公司，批号 PC0020-500），磷酸盐缓冲液（PBS）、高糖
著减少心肌梗死面积，因而是众多生长因子、细胞因子 DMEM 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（美国 Gibco 公司，
以及药物干预的靶点 [11－13] 。缺氧诱导因子 1α（HIF-1α） 批号分别为 10010049、12430047、R001100、12664025），
是缺氧转录反应的主要转录调控因子，可调节多种靶基 抑制剂 LY、抑制剂 PD、CoCl2、二甲基亚砜（美国 Sigma
因的表达，对细胞耐受缺氧环境和维持氧平衡具有重要 公司，批号分别为L9908、P215、255599、D2447），ROS检
[14]
作用，且与心肌细胞损伤的发生机制有关 。 测试剂盒、JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒、Hoechst
基于此，本研究采用氯化钴（CoCl2 ）诱导 H9c2 心肌 33342 染液、Fluo-4 AM 钙离子荧光探针、BSA 蛋白测定
细胞缺氧复氧损伤，然后检测荭草花提取物对其细胞中 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为
ROS 水平、钙离子水平（细胞质中）、线粒体膜电位 S0033S、C2006、C1026、S1060、ST025），ATP 酶试剂盒

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