Page 26 - 中国药房2021年11期
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1.2 主要药品与试剂                                         15 min，收集上层血清，备用。取血后，快速剖取大鼠肝
            本研究所用主要药品与试剂有：4-羟基-苯并噁                          组织，以生理盐水洗去其表面的血迹，以吸水纸吸干后，
        唑-2-酮（广西医科大学药化合成实验室，纯度＞99％），                        于肝大叶相同地方切取约 1 cm 的肝组织，固定于 10％
                                                                                       3
        水飞蓟宾胶囊（天津天士力圣特制药有限公司，批号                             甲醛溶液中，备用；剩余的肝组织分装到 1.5 mL 离心管
        950701001，规格 35 mg），白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）试               中，进行后续检测。
        剂 盒（深 圳 迈 瑞 生 物 医 疗 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为              2.3 大鼠血清中ALB、TP、GLB和FFA水平检测
        140918006、140818007），游离脂肪酸（FFA）试剂盒（南京                   取“2.2”项下血清样品，采用全自动生化检测仪进行
        建成生物工程研究所，批号 20190826），TUNEL 细胞凋                    分析，检测各组大鼠血清中肝功能指标（ALB、TP、GLB）
        亡 检 测 试 剂 盒（碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司 ，批 号              水平，并计算ALB/GLB比值。另外，参照相应试剂盒说
        031819190506），RIPA 裂解液（北京索莱宝科技有限公                   明书方法操作，测定各组大鼠血清中脂质代谢指标FFA
        司，批号 20200903），PVDF 膜（美国 Millipore 公司，批号            水平。
        R0JB89871），兔源 TLR4 多克隆抗体、鼠源 Bcl-2 单克隆               2.4 大鼠肝细胞凋亡情况观察
        抗体、鼠源 Bax 单克隆抗体（美国 Proteintech 公司，批号                    取“2.2”项下固定于 10％甲醛溶液中的肝组织，经
        分 别 为 19811-1-AP、60178-1-Ig、60267-2-Ig），兔 源         常规石蜡包埋处理后，切片（4 µm）并贴附于防脱载玻片
        MyD88 多克隆抗体、兔源磷酸化 NF-κB p65（p-NF-κB                 上，待烘干后，依次置于二甲苯、无水乙醇、90％乙醇、
        p65）多克隆抗体、兔源NF-κB p65多克隆抗体、兔源磷酸                     70％乙醇中进行脱蜡、脱水；再将切片按TUNEL细胞凋
        化IκBα（p-IκBα）多克隆抗体、兔源IκBα单克隆抗体、兔                    亡检测试剂盒说明书方法操作后，置于显微镜下观察，
        源 caspase-3 多克隆抗体、兔源β-actin 多克隆抗体（美国                切片中出现的棕褐色斑点即为凋亡细胞。
        CST 公 司 ，批 号 分 别 为 4283S、3033S、8242S、2859T、         2.5  大鼠肝组织中TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白
        4812S、9662S、4970S），荧光标记的山羊抗兔免疫球蛋白                   和凋亡相关蛋白的表达水平或磷酸化检测
        G（IgG）二抗（美国 Licor 公司，批号 D00804-07），荧光标                  采用Western blot法进行检测。取“2.2”项下各组大
        记 的 山 羊 抗 鼠 IgG 二 抗（美 国 Invitrogen 公 司 ，批 号         鼠肝组织适量，加入RIPA裂解液和液氮进行研磨，提取
        Tl268740）；其余试剂为实验室常用规格，水为纯净水。                       肝组织中的蛋白质，然后于 4 °C 条件下以 12 000 r/min
        1.3  动物与饲料                                          离心 20 min，取上清液，采用蛋白分析仪测定其蛋白浓
            本研究所用动物为 SPF 级 SD 大鼠，雄性，体质量                     度。蛋白经变性后，取适量进行十二烷基硫酸钠-聚丙
        114～138 g，购自广西医科大学实验动物中心，动物生产                       烯酰胺凝胶电泳，转膜；以TBST清洗5 min×3次，放入封
        许可证号为SCXK（桂）2014-0002。大鼠分笼饲养，饲养                     闭液中室温孵育 1 h；以 TBST 清洗 5 min×3 次，加入
        房间温度为21～25 ℃、湿度为40％～60％、每日光照明                       TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、
        暗交替，大鼠自由饮水和摄食。高脂饲料购自北京博爱                            caspase-3、Bcl-2、Bax一抗（除Bax一抗稀释度为1∶6 000、
        港生物技术有限公司，基础饲料购自北京科澳协力饲料                            Bcl-2一抗稀释度为1∶2 000外，其余抗体的稀释度均为
        有限公司。                                               1 ∶ 1 000），于 4 ℃条件下孵育过夜；次日以 TBST 清洗 5
        2 方法                                                min×3次，加入相对应的二抗（稀释度均为1∶10 000），于
        2.1  分组、造模与给药                                       室温在摇床上孵育1 h；再以TBST清洗5 min×3次，采用
            大鼠适应性饲养一段时间后，随机分为正常对照组                          Odyssey Clx型双色红外荧光成像仪进行扫描，并保留图
        （10只）、造模组（50只），正常对照组大鼠给予基础饲料，                       片。采用 Image J 2×软件对图片进行分析，以 p-NF-κB
        造模组大鼠给予高脂饲料，持续喂养 8 周后，分别挑选                          p65蛋白与NF-κB p65蛋白灰度值的比值、p-IκBα蛋白与
        1、3 只大鼠进行肝组织病理学检查，当造模组大鼠出现                          IκBα蛋白灰度值的比值分别表示 NF-κB p65 和 IκBα的
        显著的肝细胞脂肪变性和脂肪空泡时，表明 NAFLD 造                         磷酸化水平；以 Bcl-2 蛋白与 Bax 蛋白灰度值的比值表
               [16]
        模成功 。将造模成功的大鼠分为模型组、水飞蓟宾组                            示凋亡水平；以 TLR4、MyD88、caspase-3 蛋白灰度值分
        （阳性对照，26.25 mg/kg，剂量参考文献[15]设置）和4-羟                 别 与 内 参（β-actin）蛋 白 灰 度 值 的 比 值 表 示 其 表 达
        基-苯并噁唑-2-酮高、中、低剂量组（100、50、25 mg/kg，剂                水平。
                                     [17]
        量参考课题组前期研究结果设置 ），每组8只。各给药                           2.6 统计学方法
        组大鼠灌胃相应药物（临用时以 0.6％羧甲基纤维素钠                              采用 SPSS 24.0 软件对数据进行统计分析，数据均
        溶液为溶剂），正常对照组与模型组大鼠灌胃等体积溶                            以 x±s 表示。组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05
        剂，灌胃体积为10 mL/kg，每天1次，连续4周。                          表示差异具有统计学意义。
        2.2  标本收集                                           3 结果
            各组大鼠给药结束后禁食、不禁水，于次日上午称                          3.1 4-羟基-苯并噁唑-2-酮对 NAFLD 模型大鼠血清中
        其体质量，然后腹腔注射水合氯醛（3 mL/kg）进行麻醉，                       肝功能指标水平的影响
        以真空采血管收集全血，静置1 h后，以3 500 r/min离心                        与正常对照组比较，模型组大鼠血清中TP、GLB水


        ·1300 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 11                                 中国药房    2021年第32卷第11期
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