Page 52 - 《中国药房》2021年10期
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实验。                                                 积，取平均值，然后计算伤口愈合率：伤口愈合率（％）＝
        2.2 染料木素对CNE1细胞增殖的影响                               （0 h 时的平均划痕面积－24 h 时的平均划痕面积）/ 0 h
            采用CCK-8法进行考察。将CNE1细胞用含5％胎                       时的平均划痕面积×100％。重复实验3次。
        牛血清的 RPMI 1640 培养液制成密度为 1×10 mL 的                   2.6 染料木素对CNE1细胞中基因表达的影响
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                                                    －1
        细胞悬液，按每孔 100 μL 接种于 96 孔板中，常规培养。                        将 CNE1 细胞用含 5％胎牛血清的 RPMI 1640 培养
                                                                                －1
                                                                            5
        待细胞贴壁后，按照预实验结果，将其分为空白对照组                            液制成密度为3×10 mL 的细胞悬液，按每孔2 mL接种
        （0 µmol/L）和不同浓度染料木素组（12.5、25、50、100、                于6孔板中，常规培养。待细胞贴壁后，将细胞分为空白
        150 µmol/L），每组设置 3 个复孔，并另设调零孔。分别                    对照组和30 µmol/L染料木素组，每组设置3个复孔。加
        于加药干预 24、48、72 h 时，在每孔中加入 CCK-8 溶液                  药干预24 h后，常规消化、收集细胞。按照总RNA提取
        10 µL，继续培养2 h。使用酶标仪于450 nm波长处测定                     试剂盒方法提取细胞中总 RNA，并按照 MGIEasy RNA
        各孔的吸光度（A），计算细胞的增殖抑制率：增殖抑制率                          文库制备试剂盒方法对总RNA进行富集、反转录、扩增
        （％）＝（实验组 A 值－空白对照组 A 值）/（空白对照组 A                    和纯化等操作后得到 RNA 文库，再对 RNA 文库进行均
        值－调零孔 A 值）×100％。使用 SPSS 21.0 软件分别计                  一化、环化、酶切消化和纯化后，按照高通量测序试剂盒
        算上述 3 个时间点的半数抑制浓度（IC50 ）。实验重复                       方法对其进行芯片加载和高通量测序，以得到空白对照
        3次。                                                 组和 30 µmol/L 染料木素组细胞中基因的碱基序列（即
        2.3 染料木素对CNE1细胞周期的影响                                原始测序数据）。用FastQC 0.11.9软件对碱基序列数据
            采用流式细胞术进行测定。将CNE1细胞用含5％                         进行质量控制，用 Trimmomatic 0.36 软件去除与接头匹
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        胎牛血清的RPMI 1640培养液制成密度为1.5×10 mL               －1    配率超过30％的测序片段并过滤掉长度低于50 bp的片
        的细胞悬液，按每孔 2 mL 接种于 6 孔板中，常规培养。                      段后，再用Botie2 2.4.2软件将质量控制后的数据映射到
        待细胞贴壁后，将其分为空白对照组（0 µmol/L）和不同                       人类参考基因组上，并计算人类参考基因组中各基因的
        浓度染料木素组（15、30、60 µmol/L，以 CCK-8 实验 48 h             表达量（记为“Count”值）。利用 DESeq2 3.13 软件计算
        的 IC50为中剂量组、1/2 倍 IC50为低剂量组、2 倍 IC50为高              分析各基因表达量的差异倍数的对数值[log2 （Fold
        剂量组），每组设置 3 个复孔。加药干预 24 h 后，用含                      change）]，且得到对应的 padj 值（矫正后的 P 值），以
        0.25％EDTA 的胰蛋白酶消化液消化并收集细胞，按细                        log2 （Fold change）＜0为表达下调，log2 （Fold change）＞0
        胞周期检测试剂盒方法进行固定、染色，然后采用流式                            为表达上调，以 log2 （Fold change）＞1 且 padj＜0.05 为标
        细胞仪进行检测。使用 ModFit 5.0 软件进行图片分析，                     准筛选差异基因，利用R语言包中的ggplot2包绘制差异
        计算各个周期细胞的比例。实验重复3次。                                 基因火山图。结合上述细胞实验结果，筛选出调控相关
        2.4  染料木素对CNE1细胞凋亡的影响                               过程的8个差异基因以进行后续研究，并采用在线网站
            采用流式细胞术进行测定。细胞按“2.3”项下方法                        Morpheus（https：//software.broadinstitute.org/morpheus/）
        接种、分组和给药。加药干预 24 h后，用含0.25％EDTA                     以log 2Count值绘制热图。
        的 胰 蛋 白 酶 消 化 液 消 化 并 收 集 细 胞 ，按 照 Annexin          2.7  差异基因表达的验证
        V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒方法进行染色，然后使                           采用 RT-qPCR 法进行验证。按“2.6”项下方法进行
        用流式细胞仪测定各组细胞的凋亡情况，以Q2、Q3象限                          细胞培养、给药、收集和提取细胞中总RNA。将总RNA
        细胞所占比例之和为凋亡率。实验重复3次。                                按cDNA反转录试剂盒方法反转录成cDNA后，以cDNA
        2.5  染料木素对CNE1细胞迁移的影响                               为 模 板 使 用 SYBR Green Ⅰ 法 进 行 RT-qPCR 反 应 。
            采用细胞划痕实验进行测定。将 CNE1 细胞用含                        RT-qPCR反应体系（共20 µL）包括cDNA模板1 µL，上、
        5％胎牛血清的 RPMI 1640 培养液制成密度为 4×10                5    下游引物（10 µmol/L）各 0.4 µL，qPCR 反应缓冲液（2×）
           －1
        mL 的细胞悬液，按每孔2 mL接种于6孔板中，常规培                         10 µL，荧光染料（50×）0.4 µL，无酶水7.8 µL。反应程序
        养。待细胞贴壁后，将其分为空白对照组（0 µmol/L）和                       为94 ℃变性5 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40个
        不同浓度染料木素组（10、20、30 µmol/L，为避免过高剂                    循环。以GAPDH为内参基因，采用2              －ΔΔCt 法计算各目的
        量使细胞脱落影响实验结果准确性，以CCK-8实验48 h                        基因的相对表达量（将空白对照组的值定义为1）。实验
                                                            重复 3 次。引物序列及扩增产物长度见表 1（引物序列
        的 IC50值为高剂量组、1/2 倍 IC50为中剂量组、1/3 倍 IC50
        为低剂量组）。常规培养至细胞铺满培养孔的 90％时，                          由本课题组使用 Primer 5.0 软件自行设计，由广州天一
        在6孔板的后侧用标记笔划3条等距黑线，然后用10 µL                         辉远基因科技有限公司合成）。
        枪头在培养孔内划3条平行等距的线垂直于黑线，再给                            2.8 统计学方法
        药干预。分别在加药干预0、24 h时，每组随机选取5个                             采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。结果以
        点进行拍照。使用 Image J 1.48 软件分别测定划痕面                     x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两


        ·1198 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 10                                 中国药房    2021年第32卷第10期
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