Page 51 - 《中国药房》2021年10期

control，12.5，25，50，100，150 µmol/L genistein showed significant inhibitory effect on the proliferation of CNE1 cells（P＜
0.01），in a concentration- time-effect manner；15，30 µmol/L genistein could arrest CNE1 cell cycle at G0/G1 stage（P＜0.05 or P＜
0.01）；30，60 µmol/L could arrest CNE1 cell cycle at G2/M stage and promoted cell apoptosis（P＜0.05 or P＜0.01）. 10，20，30
µmol/L genistein could significantly inhibit the migration ability of CNE1 cells（padj＜0.01）. High throughput sequencing revealed
a total of 2 271 differentialgenes（P＜0.05），1 154 of which were up-regulated while 1 117 of which were down-regulated；8
potential target genes，including p53，p21，STC2，FGF2，CDK6，CYCLIN D，PI3K，AKT，were screened by cell experiment.
After validated by RT-qPCR assay，mRNA expression of p53，p21，STC2，FGF2，CDK6，CYCLIN D and AKT were significantly
down-regulated（P＜0.05），which consistent with the sequencing results. CONCLUSIONS：Genistein can effectively inhibit the
growth of human nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells，the mechanism of which may associated with inhibiting the expression of
mutant gene p53，restoring the function of wild-type P53 protein and inhibiting the activity of PI3K/Akt pathway.
KEYWORDS Genistein；Human nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells；High throughput sequencing；Mutant gene p53；PI3K/
Akt pathway

染料木素又称染料木黄酮、金雀异黄酮，分子式为 GNP-980 型恒温细胞培养箱购自上海精密仪器仪表公
C15H10O5，化学名为4′，5，7-三羟基异黄酮，为淡黄至浅褐 司；guava easyCyte型流式细胞仪购自默克化工技术（上
色粉末，溶于二甲基亚砜和乙醇，是一种天然的异黄酮 海）有限公司；IX73 型显微镜购自日本 Olympus 公司；
类化合，存在于千斤拔、淡豆豉、鸡血藤等多种天然药物 T100 型 PCR 仪购自美国 Bio-Rad 公司；QuantStudio 3 型
中，其结构与动物雌激素雌二醇相似，故有植物雌激素 RT-qPCR 仪 购 自 美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司 ；
之称 [1－3] 。现代药理研究表明，染料木素具有清除自由 BGIDL-50 型全自动样品加载系统、BGISEQ-500RS 型
基、抗氧化、保护心脑血管系统、预防动脉粥样硬化、防 基因测序仪均购自深圳华大智造科技股份有限公司。
治阿尔茨海默病等多种作用 [4－7] 。除此之外，染料木素 1.2 主要药品与试剂
还因具有显著的抗肿瘤作用而备受关注，如其对乳腺 染料木素对照品（批号 RFS-R00111812016，纯度＞
癌、肺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌、口腔癌、喉癌、甲状腺 98％）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；胎牛血清购
癌等多种癌症均有抑制作用 [8－15] 。 自美国Thermo Fisher Scientific公司；含0.25％乙二胺四
鼻咽癌是发病率最高的头颈部恶性肿瘤，其发病地 乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化液（批号20181218）购自北
区主要集中在我国广东、广西、福建等南部地区以及东 京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂盒（批号20200720）
[16]
南亚地区，具有显著的地域性特征 。鼻咽癌的发生主 购自杭州弗德生物科技有限公司；RPMI 1640 培养液、
要是因为感染了EB病毒，我国2014 年鼻咽癌每十万人 细胞周期检测试剂盒（批号 20201118）、荧光素 FITC 标
口的发病率和死亡率分别为3.26和1.77，显著高于世界 记的膜联蛋白 V（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）细胞
[17]
平均水平 。由于鼻咽癌发病部位深，且与众多重要器 凋亡检测试剂盒（批号 20200610）均购自江苏凯基生物
官相近，难以手术切除，放、化疗依然是鼻咽癌的主要治 科 技 股 份 有 限 公 司 ；总 RNA 提 取 试 剂 盒（批 号
疗手段，但其具有较强的副作用，临床治疗效果有 10029777）购自美国 BioLabs 公司；MGIEasy RNA 文库
[18]
限 。据相关研究表明，染料木素对雌、雄大鼠均无生 制备试剂盒（批号 A0002）、MGIEasy DNA 纯化磁珠（批
殖毒性，无致畸性，且对子代大鼠生长、发育的毒性较 号 A0212）和 BGISEQ-500RS 高通量测序试剂盒（批号
小，安全耐受，是一种安全性较高的抗肿瘤药物 [19－22] 。 A20）均购自深圳华大智造科技股份有限公司；cDNA反
高通量测序可以准确分析出肿瘤细胞和组织在基 转录试剂盒（批号 N20426）、RT-qPCR 反应试剂盒（批号
因组和转录组水平上的基因图谱，进而为不同癌症的治 O10318）均购自北京全式金生物技术有限公司；其余试
[23]
疗提供更准确的靶点信息 。鉴于此，本研究拟以人鼻 剂均为分析纯或实验室常用规格，水为超纯水。
咽癌CNE1细胞为模型，通过CCK-8实验、流式细胞术、 1.3 细胞
细胞划痕实验等方法考察染料木素对 CNE1 细胞增殖、 人鼻咽癌 CNE1 细胞（批号 CC-Y1118）购自上海酶
细胞周期、凋亡和迁移能力的影响，并与高通量测序相 研生物科技有限公司。
结合，初步考察染料木素抗鼻咽癌的作用及其潜在靶 2 方法
点，再采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法（RT-qPCR） 2.1 细胞的培养
验证潜在靶点mRNA的表达情况，为染料木素在抗鼻咽 将CNE1细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640
癌领域的进一步研究、利用提供参考。 培养液中，置于37 ℃、5％CO2的恒温培养箱中常规培养
1 材料 （培养条件下同）。每 3 天传代 1 次，每次用含 0.25％
1.1 主要仪器 EDTA的胰蛋白酶消化液消化3 min后，收集细胞继续培
M200 Pro 型多功能酶标仪购自瑞士 Tecan 公司； 养。待传至 10～20 代时，取对数生长期细胞进行后续

中国药房 2021年第32卷第10期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 10 ·1197 ·