Page 72 - 《中国药房》2021年第9期
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保肝活性部位，并对该活性部位的化学成分进行解析，                            细胞悬液，按每孔0.1 mL接种于96孔板中，置入37 ℃、
        以期为该药材保肝活性的物质基础研究和作用机制阐                             5％ CO2培养箱中（以下培养条件相同）培养 24 h 后，随
        释提供理论依据。                                            机分为DMSO对照组（不含药物、只含5‰DMSO溶液）、
        1 材料                                                正常组（不含药物、也不含DMSO）、模型组（对乙酰氨基
        1.1 主要仪器                                            酚 2 mg/mL，剂量设置参考本课题组前期实验结果）和
            本研究所用主要仪器包括JEOL-AL300型核磁共振                      各萃取部位组（40 μg/mL，均以生药量计，剂量设置参考
        波谱仪（日本JEOL公司）、R.K.I型CO2细胞培养箱（日本                     本课题组前期实验结果），每组均设置6个复孔。各组细
        Ikemoto 公司）、DG3022A 型酶联免疫检测仪（南京华东                   胞加入上述对应药液或5‰DMSO溶液后，培养24 h，每
        电子集团有限公司）、HH-S 型水浴锅和 RE-SZA 型旋转                     孔加入 0.5 mg/mL MTT 试剂 20 µL；继续培养 4 h，弃去
        蒸发和SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器                         培养基，加入 DMSO 150 µL，振荡 10 min。使用酶联免
        有限责任公司）、WFH-203B型三用紫外分析仪（上海精                        疫检测仪于490 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值并
        科实业有限公司）、TDZ4-WS 型台式低速离心机（长沙                        计算细胞存活率：细胞存活率＝（实验组平均 OD 值/正
        湘仪离心机仪器有限公司）、BCD233 型冷藏冰冻箱（青                        常组平均OD值）×100％       [7－8] 。实验重复6次。
        岛海尔电器股份有限公司）等。                                          采用 SPSS 13.0 软件对数据进行统计分析，计量资
        1.2 主要药材与试剂                                         料以 x±s 表示，组间比较采用 t 检验，P＜0.05 为差异有
            山苦荬全草于2017年5月采自内蒙古赤峰，经内蒙                        统计学意义。山苦荬各萃取部位对肝细胞存活率的影
        古医科大学药学院王素巍讲师鉴定为菊科苦荬菜属植                             响见表1。由表1可见，与正常组比较，DMSO对照组细
        物山苦荬 I. chinensis（Thumb）Nakai；标本保存于阴凉               胞存活率无显著变化（P＞0.05），提示以5‰DMSO溶液
        干燥处。                                                溶解样品对细胞影响不大；与正常组比较，模型组细胞
            对乙酰氨基酚片（批号190811，规格0.5 g）购自石药                   存活率显著降低（P＜0.01），提示2 mg/mL对乙酰氨基酚
        集团欧意药业有限公司；Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶                     可导致人正常肝细胞损伤；与模型组比较，山苦荬各萃
        （粒径 27～163 μm）、DS-401 大孔吸附树脂（粒径 0.3～                取部位组细胞的存活率均显著升高（P＜0.01），其存活
        1.25 mm）均购自天津市海光化工有限公司；柱层析硅                         率大小依次为剩余水部位组＞正丁醇萃取部位组＞乙
        胶[粒径分别为100～200目（拌样）、200～300目（装柱）]                   酸乙酯萃取部位组＞石油醚萃取部位组，提示山苦荬不
        购自青岛海洋化工有限公司；RPMI 1640培养液购自德                        同萃取部位对人肝细胞损伤均有一定的保护作用。
        国 AppliChem 公司；青霉素、链霉素、胰蛋白酶、二甲基                     表1   山苦荬各萃取部位对肝细胞存活率的影响（x±±s，
        亚砜（DMSO）、MTT 试剂均购自美国 Sigma 公司；胎牛                         n＝6）
        血清（FBS）购自美国Gibco公司；其余试剂均为分析纯，                       Tab 1  Effects of each fraction of I. chinensis on the
        水为纯化水。                                                     survival rate of hepatocytes（x±±s，n＝6）
        1.3  细胞株                                            组别            存活率，％      组别             存活率，％
            人正常肝细胞株 HL-7702 购自中国科学院上海生                      正常组           101.4±1.1  乙酸乙酯萃取部位       26.1±1.7 ##
                                                            DMSO对照组       100.0±0.9  正丁醇萃取部位        49.3±3.4 ##
        命科学研究院细胞资源中心。
                                                            模型组           13.2±0.5 ＊＊  剩余水部位        52.2±2.2 ##
        2 方法与结果                                             石油醚萃取部位       23.2±2.6 ##
        2.1  山苦荬不同萃取部位的制备                                      注：与正常组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.01
                                                                            ＊＊
                                                                                              ##
            采用系统溶剂法提取。取山苦荬全草 5 kg，剪碎，                          Note：vs. normal group， P＜0.01；vs. model group，P＜0.01
                                                                                                  ##
                                                                               ＊＊
        装入纱布袋中，用 10 倍量（L/kg）70％乙醇浸泡提取 3                     2.3 山苦荬保肝活性部位化学成分的分离鉴定
        次，每次 48 h。合并提取液，减压浓缩，依次用石油醚、                        2.3.1 正丁醇萃取部位的分离纯化
        乙酸乙酯、正丁醇萃取1次，萃取溶剂与浓缩液的体积比                               参考“2.2”项下结果，本课题组先针对活性较高、极
        均为 2 ∶ 1。将各溶剂萃取液溶剂回收后，分别得石油醚                        性相对适中的正丁醇萃取部位进行化学成分分离，剩余
        萃取部位（52 g）、乙酸乙酯萃取部位（27 g）、正丁醇萃取                     水部位的化学成分研究尚在进行中（拟后续另文报
        部位（133 g）以及剩余水部位（209 g）。称取上述 4 种萃                   道）。取正丁醇萃取物133 g，经DS-401大孔吸附树脂柱
        取部位适量，用5‰DMSO溶液溶解，然后用RPMI 1640                      粗分离后，以水-甲醇（100 ∶ 0～0 ∶ 100，V/V）梯度洗脱，再
        培养液稀释，制得最终质量浓度均为 40 μg/mL（以生药                       经薄层色谱（TLC）鉴别后，得 30％、50％、70％、90％甲
        量计）的萃取部位药液，置于4 ℃冰箱中保存，以备后续                          醇和水洗脱物。各洗脱部位经反复硅胶柱色谱分离，以
        保肝活性筛选实验所用。                                         不同比例氯仿-甲醇-水进行洗脱，再借助 Sephadex
        2.2  山苦荬保肝活性部位的筛选                                   LH-20葡聚糖凝胶柱纯化、重结晶、TLC鉴别等方法，得
            采用MTT法检测。取对数生长期的HL-7702细胞，                      到8个化合物。其中，从50％甲醇洗脱物中分离得化合
                                              4
        用RPMI 1640培养液稀释，制得密度为5×10 mL 的单                     物Ⅰ（18 mg）、Ⅱ（20 mg）、Ⅶ（15 mg）；从 70％甲醇洗脱
                                                  －1
        ·1090 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 9                                   中国药房    2021年第32卷第9期
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